膿毒癥患者血清微小RNA-21的水平變化及其意義

李偉超,張亭,潘尉,楊建海

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第983醫(yī)院,天津300142)

膿毒癥主要是指由感染因素引發(fā)的一種全身炎癥反應綜合征，是臨床上嚴重創(chuàng)傷、感染、休克患者最為常見的并發(fā)癥之一，如不給予及時有效治療，隨著病情不斷進展會引發(fā)膿毒癥休克以及多器官功能障礙綜合征，是導致重癥監(jiān)護病房患者死亡的最主要原因之一[1]。盡管目前我們對膿毒癥的發(fā)病機制有了一定的認識，但其病死率仍未得到有效控制[2]。因此，尋找一種可早期診斷膿毒癥的生物標記物顯得尤為重要。微小RNA(miRNAs)主要是通過調(diào)節(jié)基因的表達，從而有效調(diào)節(jié)細胞新陳代謝以及分化、增殖、凋亡等過程，進一步在機體生理病理過程中發(fā)揮至關重要的作用[3]。有研究報道顯示，miRNAs在膿毒癥患者中存在異常表達，其可能成為膿毒癥患者早期診斷以及預后評估有效指標[4]。miRNA-21是微小RNA的一個重要亞型，其與機體的炎癥反應具有一定關聯(lián)性。目前，臨床上關于miRNA-21與膿毒癥關系的報道較少。本研究觀察了膿毒癥患者血清miRNA-21水平的變化，并探討了其與病情、預后的關系，同時評估了其診斷價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年1月～2018年6月中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第983醫(yī)院收治的膿毒癥患者83例(膿毒癥組)，男52例、女31例，年齡24～71(48.35±10.42)歲。納入標準[5]:與拯救膿毒癥戰(zhàn)役(SSC)關于膿毒癥最新診斷標準相符；住院時間≥5 d；臨床病歷資料完整。排除標準:合并心、肝、腎等臟器功能嚴重障礙者；伴有腦梗死或急性冠脈綜合征者；伴有腫瘤疾病或免疫系統(tǒng)疾病者。

根據(jù)患者病情嚴重程度:一般膿毒癥[5]50例(無休克組)、休克性膿毒癥(由膿毒癥導致的低血壓經(jīng)液體復蘇后收縮壓仍<90 mmHg，需予以升壓藥物維持者)33例(休克組)。另取同期于本院進行體檢的健康者50例作為對照組，其中男32例、女18例，年齡23～73(49.01±10.28)歲。膿毒癥組與對照組性別、年齡有可比性。

1.2 臨床病情嚴重程度的評估 入院24 h內(nèi)采用急性生理功能和慢性健康狀況評分系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ)評分及有無休克評估患者的病情嚴重程度。

1.3 血清miRNA-21檢測 膿毒癥組分別于入院第1、3、5天，對照組于入院體檢時采集外周靜脈血5 mL，以3 000 r/min離心10 min，取上層血清保存于-80 ℃冰箱中待檢。根據(jù)mir Vana PARIS試劑盒說明書提取血清總RNA，并在稀釋后參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書完成逆轉(zhuǎn)錄反應，其反應體系包括RTace 0.5 μL，RT 5×Buffer 4 μL，RNase抑制劑0.5 μL，稀釋后的RNA 12 μL，逆轉(zhuǎn)錄引物RT prime 1 μL，dNTP 2 μL。逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA進行稀釋，采用qRT-PCR技術(shù)測定miRNA-21。miRNA-21上游引物序列:5’-CGGCGGTAGCTTATCAGACTG-3’；下游引物序列:5’-AATGGTTGTTCTCCACACTCTC-3’；以U6為內(nèi)參，上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′、下游引物:5′-AACGCT-TCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應體系:cDNA 1 μL，DEPC水3 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，SYBR 5 μL。95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)進行PCR擴增，用2-ΔΔCt表示血清miRNA-21的相對表達量。

1.4 血清miRNA-21的水平與膿毒癥患者預后關系分析 對所有膿毒癥患者進行隨訪，隨訪截止日2018年7月26日或患者死亡。記錄患者生存情況。按照28 d病死率分為存活組67例與死亡組16例，比較兩組血清miRNA-21水平，以評估血清miRNA-21水平與預后的關系。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同時間點血清miRNA-21水平比較 膿毒癥組入院第1、3、5天血清miRNA-21水平分別為(1.97±0.90)、(1.02±0.71)、(0.53±0.31)ng/μL，對照組為(0.48±0.33)ng/μL。各指標組間(F=106.438)、時間(F=80.932)及交互作用(F=80.932)均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。與入院第1天比較，膿毒癥組入院第3、5天miRNA-21水平均低(P均<0.05)。入院第1、3天膿毒癥組血清miRNA-21水平均高于對照組(P均<0.05)。

2.2 休克組與無休克組血清miRNA-21、APACHEⅡ評分比較 入院第1天休克組、無休克組血清miRNA-21水平分別為(2.66±0.48)、(1.27±0.28)ng/μL，APACHEⅡ評分分別為(31.95±4.87)、(16.32±2.59)分。休克組血清miRNA-21水平及APACHEⅡ評分均高于無休克組(t分別為15.106、16.917，P均<0.05)。

2.3 血清miRNA-21檢測對膿毒癥的診斷價值 入院第1天血清miRNA-21診斷膿毒癥的敏感度為73.47%，特異度為38.29%，ROC下面積為0.752(95%CI=0.501～1.003，P=0.008)，第3天血清miRNA-21診斷膿毒癥的敏感度為62.94%，特異度為35.71%，ROC下面積為0.722(95%CI=0.452～0.992，P=0.015)。

2.4 血清miRNA-21水平與膿毒癥患者生存情況的關系 存活組入院第1、3、5天血清miRNA-21水平分別為(1.65±0.49)、(0.78±0.15)、(0.48±0.13)ng/μL，死亡組分別為(3.03±0.78)、(1.53±0.32)、(1.02±0.09)ng/μL。各指標組間(F=404.437)、時間(F=586.825)及交互作用(F=40.688)比較,P均<0.05。入院第1、3、5天，存活組血清miRNA-21水平均低于死亡組(P均<0.05)。

3 討論

膿毒癥屬于嚴重創(chuàng)傷、感染以及休克最為常見的并發(fā)癥之一[6]。在膿毒癥的發(fā)展過程中，特征性補體系統(tǒng)的激活以及先天免疫系統(tǒng)的過度活化等因素會影響巨噬細胞與中性粒細胞對細胞因子、趨化因子等炎性介質(zhì)的反應，從而分泌更多的氧自由基等刺激炎癥介質(zhì)，進一步加劇了炎癥反應，促使機體調(diào)控機制失調(diào)，繼而對組織器官造成損傷，最終導致機體膿毒癥休克甚至死亡[7]。由此，盡早地對膿毒癥進行診斷，評估膿毒癥患者病情嚴重程度以及預后是早期有效控制膿毒癥發(fā)展、降低膿毒癥患者死亡率的重要途徑。既往，臨床上主要是通過臨床癥狀、體征檢查，血常規(guī)檢查以及病原菌檢查等方式診斷膿毒癥[8，9]。然而，臨床癥狀、體征檢查以及病原菌檢查受主觀性的影響較大，可能導致診斷結(jié)果出現(xiàn)誤差；血常規(guī)檢測無法對膿毒癥進行早期診斷，存在一定的局限性。隨著相關研究的不斷深入，越來越多的學者發(fā)現(xiàn)，miRNA-21在多種炎性狀態(tài)下表達升高，且在血清中穩(wěn)定存在，這為血清miRNA-21作為膿毒癥的生物標記物提供了理論依據(jù)[10]。

miRNA-21屬于miRNAs家族中的一個亞型，主要位于17q23.2染色體FRA17脆性區(qū)域上，存在高度保守性，在血清等體液中穩(wěn)定存在，在多種炎性狀態(tài)表達均顯著升高，不但可自己調(diào)控促炎因子以及抑炎因子的表達，同時可通過對炎癥信號傳導通路的其他關鍵分子產(chǎn)生作用，從而可有效反映膿毒癥患者的炎癥狀態(tài)[10]。本研究結(jié)果表明，入院第1、3天膿毒癥組血清miRNA-21水平均高于對照組，休克組血清miRNA-21、APACHEⅡ評分均高于無休克組，提示膿毒癥患者血清miRNA-21水平升高，隨著膿毒癥患者病情的逐漸加重，血清miRNA-21水平逐漸升高，其主要原因可能是因為膿毒癥癥狀的加劇導致了患者機體中的炎癥狀態(tài)更加明顯，進而誘發(fā)了血清miRNA-21水平上升，提示血清miRNA-21水平與膿毒癥患者的病情有關。

本研究中，我們將入院第1、3天的血清miRNA-21檢測進行ROC分析，結(jié)果顯示第1、3天血清miRNA-21診斷膿毒癥的ROC下面積為0.752及0.722，敏感度分別為73.47%、62.94%，，特異度分別為38.29%、35.71%，與劉姿等[11]研究報道相符，提示其可作為臨床膿毒癥的早期診斷指標之一，但其特異度并不是很高。有研究[12，13]報道，血清miRNA-21在多種腫瘤以及心血管疾病患者中均存在不同程度的異常表達。因此認為，miRNA-21可能并非是膿毒癥的特有指標，臨床工作中可通過聯(lián)合其他標志物(如PCT)以及相關臨床資料進行綜合檢測，從而提高膿毒癥早期診斷的準確性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，入院第1、3、5天存活組患者血清miRNA-21水平均低于死亡組，提示血清miRNA-21可能與膿毒癥患者的預后也有關系，其原因主要是miRNA-21的表達升高可能對機體全身性炎癥反應的爆發(fā)產(chǎn)生一定程度的影響，從而導致血清中白細胞介素-6、白細胞介素-8以及腫瘤壞死因子-α等一系列炎癥因子過量釋放，進一步導致患者病情逐漸惡化，甚至死亡。

綜上所述，膿毒癥患者血清miRNA-21水平升高，其水平變化可反映患者病情嚴重程度，有助于膿毒癥的早期診斷，且有利于預后的評估。需要指出的是，本研究也有一定的不足之處，比如研究樣本量比較少，且隨訪時間也相對較短，今后可通過擴大樣本量、并延長隨訪時間的方式獲得更加準確的研究結(jié)果。