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    接受常規(guī)體外受精、卵胞漿內(nèi)單精子注射者囊胚培養(yǎng)及妊娠結局對比觀察

    2019-05-07 09:19:08劉文婷楊菁
    山東醫(yī)藥 2019年9期
    關鍵詞:卵裂體外受精囊胚

    劉文婷,楊菁

    (武漢大學人民醫(yī)院生殖中心,武漢430060)

    體外受精是指在體外環(huán)境中將成熟卵子和精子在人工控制環(huán)境下相互作用并結合成受精卵的過程。根據(jù)精子和卵子孵育時間以及精子進入卵子內(nèi)部方式可將體外受精分為常規(guī)體外受精、短時體外受精、ICSI授精以及補救ICSI授精等。目前最常見體外受精方式為常規(guī)體外受精(IVF)和卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)。國內(nèi)已有學者對兩種受精方式的囊胚形成率及妊娠結局進行了比較,認為在同樣的選擇性囊胚培養(yǎng)納入標準下,相比于ICSI,接受IVF者囊胚形成率和胚胎利用率更高[1],但由于沒有考慮到IVF與ICSI兩種受精方式在精液參數(shù)上存在明顯差異,無法排除因精液參數(shù)的差異而導致不同受精方式囊胚培養(yǎng)結局的差異。本研究中,我們除了根據(jù)受精方式不同進行分組以外,并根據(jù)精液參數(shù)的不同將ICSI進一步分為正常精液與少弱精子精液亞組,比較不同受精方式的囊胚培養(yǎng)結局及凍融囊胚移植妊娠結局,以探討不同受精方式對囊胚培養(yǎng)結局及妊娠結局的影響。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料 選擇2015年1月~2017年12月在湖北省婦幼保健院生殖中心接受常規(guī)體外受精(IVF)/卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)的女性受者1 230例。納入標準:女方年齡≤35歲;可獲取新鮮的卵子和精液者;囊胚培養(yǎng)第3天(D3)可利用胚胎數(shù)≥6(可利用胚胎為卵裂球數(shù)目≥4,且碎片≤25%)且未行胚胎冷凍;凍融周期囊胚移植者。排除標準:卵巢功能異常者;精液來源于附睪穿刺取精和睪丸穿刺取精者;行新鮮周期囊胚移植者。按受精方式不同分為IVF組994例、ICSI組236例,ICSI組按照精液參數(shù)的不同分為ICSI正常精液組90例、ICSI少弱精組146例。IVF組平均年齡29.27歲、平均不孕年限2.92年、平均獲卵數(shù)20.24個、平均囊胚移植數(shù)1.86個、平均治療周期數(shù)1.13個、平均BMI 25.56 kg/m2、平均基礎卵泡刺激激素(FSH)6.12 IU/L,ICSI少弱精組組平均年齡29.11歲、平均不孕年限3.04年、平均獲卵數(shù)21.89個、平均囊胚移植數(shù)1.83.個、平均治療周期數(shù)1.16個、平均BMI 1.93 g/m2、平均FSH 5.88 IU/L,ICSI正常精液組平均年齡30.38歲、平均不孕年限3.02年、平均獲卵數(shù)18.22個、平均囊胚移植數(shù)1.81個、平均治療周期數(shù)1.24個、平均BMI 22.14 kg/m2、平均FSH 6.14 IU/L。三組年齡、獲卵數(shù)、囊胚移植數(shù)、治療周期數(shù)、不孕年限、BMI以及基礎FSH比較無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。

    1.2 卵子、精子的提取及體外受精 卵子的提取:當患者一半以上卵泡直徑≥14 mm時,于當晚注射重組HCG,36 h后陰道超聲引導下 取卵。精子的提取:入選患者均禁欲3~7 d,收集手淫當日新鮮精液;IVF患者采用密度梯度離心法洗滌,后通過上游法收集上層精子,在授精皿中調(diào)至合適濃度待授精。ICSI組的顯微注射均由高年資經(jīng)驗豐富的工作人員操作,排除因人員技術對胚胎發(fā)育的影響。ICSI少弱精患者因精子參數(shù)差為保證獲得足夠的精子,采用微量梯度離心法或直接離心法。ICSI正常精液組采用密度梯度離心法洗滌后,利用精子自身運動上游將活動的精子從精液中分離出來。授精:IVF組在HCG注射后39~40 h內(nèi)完成授精,ICSI少弱精組和ICSI正常精液組取卵后3~4 h用80 IU/mL的透明質(zhì)酸酶去除卵丘顆粒細胞,將排出第一極體的成熟卵子行ICSI。授精16~18 h,在光學顯微鏡下觀察受精情況,出現(xiàn)雙原核視為正常受精。根據(jù)Peter卵裂期胚胎評分標準評估D3胚胎質(zhì)量,優(yōu)胚為D1出現(xiàn)雙原核,D2卵裂球數(shù)目2~5個,D3卵裂球數(shù)目≥6個且碎片≤10%。

    1.3 囊胚培養(yǎng)及移植 將符合囊胚培養(yǎng)患者(年齡≤35歲;D3可利用胚胎數(shù)≥6)的胚胎采用序貫培養(yǎng)基(SAGE)進行囊胚培養(yǎng)至第5~6天,按Gardner囊胚分級系統(tǒng)對囊胚進行分級,然后冷凍囊胚。根據(jù)囊胚腔的大小和是否孵出將囊胚的發(fā)育分為6個時期:1期:早期有腔室囊胚,囊胚腔體積小于胚胎總體積的1/2;2期:囊胚腔體積大于或等于胚胎總體積的1/2;3期:擴張囊胚,囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的總體積;4期:囊胚腔完全充滿胚胎,胚胎總體積變大,透明帶變??;5期:正在孵出,囊胚的一部分從透明帶中逸出;6期:孵出囊胚,囊胚全部從透明帶中逸出。處于3~6期的囊胚,還需對其內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞進行分級。內(nèi)細胞團分級:A級:細胞數(shù)目多,排列緊密;B級:細胞數(shù)目少,排列松散;C級:細胞數(shù)目很少。滋養(yǎng)層分級:A級:上皮細胞層有較多的細胞組成,結構致密;B級:上皮細胞層由不多的細胞組成,結構松散;C級:上皮細胞層由稀疏的細胞組成,大細胞很少。將D5或D6評分3AA、3BA、3AB、4AA、4BA、4AB的囊胚定義為優(yōu)質(zhì)囊胚。囊胚移植:采用玻璃化試劑(KITAZATO)解凍囊胚,凍融囊胚復蘇后在囊胚培養(yǎng)液中培養(yǎng)至少2 h,能重新擴張成正常內(nèi)細胞團和正常外滋養(yǎng)層形態(tài)的囊胚視為存活。將待移植囊胚移入移植皿,用培養(yǎng)液潤洗移植內(nèi)管,鏡下不超過20 μL培養(yǎng)液裝胚胎。由實驗室工作人員將移植管移交給臨床醫(yī)生,在腹部B超引導下進行胚胎移植。對于移植囊胚后妊娠者給予黃體酮支持10~12周。

    1.4 胚胎質(zhì)量、囊胚培養(yǎng)及臨床妊娠結局的觀察 ①胚胎質(zhì)量參數(shù)(包括正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率):IVF正常受精率=(D1出現(xiàn)2PN及2PB卵子數(shù))/IVF加精卵子總數(shù)×100%;ICSI正常受精率=(D1出現(xiàn)2PN及2PB卵子數(shù))/注射MⅡ卵子總數(shù)×100%;卵裂率=D2卵裂胚胎數(shù)/正常受精卵子數(shù);優(yōu)胚率=優(yōu)胚數(shù)/2PN卵裂數(shù)×100%。②囊胚培養(yǎng)結局(囊胚形成率、胚胎種植率):囊胚形成率=(D5/6總囊胚數(shù))/正常受精卵子數(shù)×100%;胚胎種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%。③臨床妊娠結局:臨床妊娠率=妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%。妊娠結局判定:囊胚移植14 d檢測尿、血HCG陽性為生化妊娠,囊胚移植28 d B超見孕囊為臨床妊娠。

    2 結果

    共納入1 230個取卵周期,IVF組994個,ICSI組236個,其中ICSI正常精液組90個、ICSI少弱精組146個。

    2.1 三組胚胎質(zhì)量參數(shù)比較 三組正常受精率、卵裂率、優(yōu)胚率比較,P均>0.05,見表1。排除D3養(yǎng)囊胚前因胚胎質(zhì)量差異導致的囊胚形成率的差異。

    表1 三組胚胎質(zhì)量參數(shù)

    2.2 三組囊胚培養(yǎng)結局及臨床妊娠結局比較 IVF組囊胚形成率高于ICSI少弱精組和ICSI正常精液組(P均<0.01);ICSI少弱精組和ICSI正常精液組囊胚形成率比較,P>0.05。三組胚胎種植率、臨床妊娠率比較,P均>0.05,見表2。

    表2 三組囊胚形成率、胚胎種植率及臨床妊娠率

    3 討論

    相比于ICSI,IVF的受精方式更接近自然受精過程,精子和卵子通過自然篩選和選擇結合在一起,能與卵子自然結合的精子在DNA的完整性上優(yōu)于不能與卵子結合的精子[2]。ICSI讓男性不育癥,特別少弱畸精癥的患者或常規(guī)IVF不受精,或受精率很低的患者得到有效治療,但是這種受精方式失去了自然選擇過程。有研究[3]發(fā)現(xiàn),ICSI授精顯微鏡下人為選擇活力和形態(tài)學正常的精子在染色體和DNA碎片上也可能存在一定異常。也有研究[4]表明,精子DNA碎片與IVF/ICSI早期胚胎發(fā)育顯著相關,精子DNA碎片越高、IVF/ICSI結局也越差。精子本身的缺陷有可能導致卵裂期胚胎在4-8細胞發(fā)育階段以及囊胚發(fā)育階段發(fā)育緩滯[5]。本研究中ICSI少弱畸精組和ICSI正常精液組優(yōu)胚率、囊胚形成率、臨床妊娠率及胚胎種植率差異均無統(tǒng)計學意義,提示在我們在現(xiàn)有的技術條件下行ICSI,通過顯微鏡挑選形態(tài)學正常的精子,可降低精液參數(shù)差異導致的胚胎發(fā)育障礙風險,但本研究也有自身的局限性,在納入標準中能達到囊胚培養(yǎng)標準的患者,并未包含極端形態(tài)異常致無法挑選出正常形態(tài)精子的特殊患者。

    囊胚培養(yǎng)是在適宜的培養(yǎng)條件下,延長體外胚胎培養(yǎng)至第5~6天的囊胚階段。囊胚培養(yǎng)能篩選更有潛力的胚胎,且囊胚期移植與子宮內(nèi)膜發(fā)育更同步、有更低的異位妊娠率、更好的抗凍能力以及有利于胚胎植入前遺傳學診斷等諸多優(yōu)勢。已有研究[6~9]表明,囊胚培養(yǎng)可篩選出發(fā)育潛能較好的胚胎,且囊胚期移植更接近生殖內(nèi)膜環(huán)境,顯著提高了胚胎種植率。囊胚期移植的優(yōu)勢也很明顯,選擇高質(zhì)量的囊胚進行移植可顯著提高胚胎種植率及臨床妊娠率。囊胚培養(yǎng)也有不足之處,要求條件高,有可能因為實驗室培養(yǎng)條件或胚胎自身原因,胚胎停止發(fā)育或退化,導致沒有胚胎可移植。由于體外培養(yǎng)環(huán)境終究不是體內(nèi)自然環(huán)境,延長培養(yǎng)時間也可能使一部分能夠著床的卵裂期胚胎退化。目前大多數(shù)生殖中心根據(jù)受者年齡、治療周期數(shù)、受精數(shù)、獲卵數(shù)和D3優(yōu)胚數(shù)等指標以及自身意愿綜合考慮是否進行囊胚培養(yǎng),以提高囊胚形成率,但受精方式對于囊胚培養(yǎng)結局是否有影響還未有定論。汪彩珠等[1]研究報道,選擇IVF授精方式的受者比選擇ICSI授精方式的受者有更高的囊胚形成率。本研究結果顯示,IVF組、ICSI正常精液組2PN受精率、卵裂率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率及胚胎種植率均無統(tǒng)計學差異,但囊胚形成率卻有統(tǒng)計學差異。提示,接受不同受精方式的受者囊胚形成率有差異,這個差異可能與體外不同受精方式的操作過程有關,具體原因考慮如下:ICSI操作會增加選擇DNA受損精子和侵入外源性物質(zhì)(PVP或者培養(yǎng)液)及垂直傳遞親代遺傳缺陷的風險[10~12];ICSI在操作過程中對卵母細胞的微管、微絲系統(tǒng)和紡錘體可能產(chǎn)生機械損傷[13,14];ICSI受精會增加超微結構異常及內(nèi)部DNA微缺失的精子注入卵母細胞的風險,雖然這項操作并不影響卵子受精,但可能導致胚胎發(fā)育緩滯影響囊胚形成[15~17];當精子DNA碎片率小于8%時,卵子可自行修復,但超過這個范圍將會影響胚胎的發(fā)育潛能[18]。

    總之,接受不同授精方式的受者囊胚形成率有差異,妊娠結局類似。至于授精方式對于囊胚培養(yǎng)結局及妊娠結局是否有影響,需要進一步進行多因素回歸分析及更多的臨床研究證實。

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