柳杉遺傳資源及其研究進(jìn)展

袁美靈，文亞峰*，武星彤，李鑫玉，王敏求，蔡夢穎，李 霞，張 原

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)風(fēng)景園林學(xué)院，湖南 長沙 410004；2.日本筑波大學(xué)生命環(huán)境科學(xué)研究科，日本 筑波 305-8577)

柳杉為杉科(Taxodiaceae)柳杉屬(CryptomeriaD. Don)常綠大喬木，分為柳杉(也稱中國柳杉，Cryptomeriafortunei)和日本柳杉(Cryptomeriajaponica)兩個種(中國植物志)。柳杉為我國特有，日本柳杉原產(chǎn)日本，與柳杉表型差異不大。柳杉起源于中生代白堊紀(jì)后期，曾廣泛分布于北半球，受第四紀(jì)氣候、地質(zhì)變化，特別是全新世以來人類活動的影響，其天然林急劇減少，目前僅在中國東南部地區(qū)和日本島有少量間斷(孤立)分布[1]。柳杉四季常綠，樹形優(yōu)美，材質(zhì)優(yōu)良，適應(yīng)性強(qiáng)，生長快，是良好用材林和園林綠化樹種。相比較而言，我國柳杉研究相對滯后，日本柳杉在群體分布、資源特征、分子遺傳學(xué)和遺傳育種等方面都有較全面而深入的研究。本文結(jié)合國內(nèi)外柳杉現(xiàn)有研究基礎(chǔ)，對其資源分布與特征、遺傳學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行述評，提出當(dāng)前柳杉研究中存在的問題，就其今后研究重點(diǎn)進(jìn)行展望。對柳杉資源保護(hù)和我國柳杉育種研究具有重要的參考價值。

1 柳杉遺傳資源及其特征

1.1 資源分布

作為古老的第三紀(jì)孑遺植物，中國柳杉天然林主要分布于浙江省天目山、福建省武夷山、天寶巖等地，江蘇、安徽、湖南、湖北、四川等地有人工林栽培[2]。日本柳杉天然林分布較為廣泛，從日本北部的青森縣( 北緯 40°42′)至南部的鹿兒島縣( 北緯 30°15′)都有間斷分布，垂直分布最高海拔可達(dá) 1 850 m[3]。日本柳杉在我國山東青島、蒙山，上海，江蘇南京、江浦，浙江杭州，江西廬山，湖南衡山，湖北武昌、武漢等地有引種栽培(中國植物志)。

1.2 資源特征

柳杉為常綠大喬木，樹冠圓錐形，樹干通直。小枝細(xì)長，常下垂，葉鉆形，呈螺旋狀排列。雌雄同株，風(fēng)媒傳粉，花期4 月，球果10 月成熟[4]，種子近圓形，扁平，邊緣具窄翅。中國柳杉與日本柳杉在形態(tài)上差異不大，不同之處在于中國柳杉小枝相對柔軟，老葉微內(nèi)彎，球果種鱗20左右，每種鱗有兩粒種子。日本柳杉小枝堅(jiān)硬，葉直伸，通常不內(nèi)彎，種鱗 20 ～ 30之間，各有 3～5粒種子，苞鱗的尖頭和種鱗先端的缺齒均較長。由于生長環(huán)境的差異，日本柳杉可分為兩個不同的生態(tài)型[5]，ura-sugi(C.japonicavar.radicans)主要分布于日本海附近，其小枝細(xì)長，針葉柔軟，具有較強(qiáng)的抗寒和抗雪壓能力；分布于太平洋沿岸的omote-sugi類型小枝粗糙，針葉較硬，抗性較差。

中國柳杉和日本柳杉生態(tài)習(xí)性相似，喜濕度大且多云霧的山地氣候，適宜生長在土質(zhì)肥沃，松軟潮濕，排水良好的酸性土壤中。中國柳杉生境以年均溫14 ℃～19 ℃，年降水量在 1 000 mm以上的海洋性或亞熱帶山地氣候?yàn)橐?，海拔分?00 m～1 400 m，以山地黃棕壤、黃紅壤或黃壤為主[6]。日本柳杉適宜年均溫12 ℃～14 ℃，年降水量 1 000 mm～1 200 mm，相對濕度80%以上的地區(qū)生長，分布區(qū)土壤類型以山地黃棕壤及棕壤為主[7]。日本柳杉比中國柳杉更耐寒和耐干旱瘠薄，抗雪壓、風(fēng)害能力強(qiáng)[8]。

1.3 特異種質(zhì)資源

1.3.1 雄性不育種質(zhì)

柳杉花粉過敏癥在日本是一個嚴(yán)重的社會問題，選育雄性不育或花粉稀少品種是日本柳杉的主要育種目標(biāo)之一。1992年第1株完全無花粉的柳杉種質(zhì)在日本富山縣被發(fā)現(xiàn)[9]，截至目前，日本已從7個縣選育得到23個雄性不育種質(zhì)資源[10]。這些種質(zhì)在形態(tài)上較同齡的正常植株矮小，花粉發(fā)育時間較晚[11]，雄花少[12]，花粉稀少甚至無花粉[11]。在日本，雄性不育遺傳學(xué)和育種研究已有大量而深入的開展，如雄性不育個體(品種)的選育、親緣關(guān)系研究、雜交育種、雄性不育基因的定位與克隆等。在我國，柳杉花粉過敏癥等問題在醫(yī)療方面有報道[13,14]，但目前尚未發(fā)現(xiàn)中國柳杉雄性不育或花粉稀少種質(zhì)資源，相關(guān)研究工作未開展。

1.3.2 多倍體種質(zhì)

日本柳杉存在異倍體植株，三倍體[15]和三體型[16]類型在日本柳杉中均有發(fā)現(xiàn)和報道。植物異倍體植株由于染色體在減數(shù)分裂時出現(xiàn)異常，導(dǎo)致其育性低，種子實(shí)生繁殖困難，多采用扦插和嫁接繁殖方法。Zinnai I[17]在1年和2年生的日本柳杉苗木中發(fā)現(xiàn)四倍體植株，其氣孔帶排列紊亂，氣孔大小增加約30%。形態(tài)上四倍體日本柳杉幼苗矮小，成活率低，生長速度慢，不適宜用于人工造林[18]，但可作為良好的育種資源。

2 柳杉資源遺傳變異研究

2.1 表型遺傳變異

表型是具有特定基因型的個體在一定環(huán)境條件下所表現(xiàn)出來的性狀特征的總和，是表達(dá)遺傳多態(tài)性的外在特征。大量研究表明[19～21]，多年生柳杉生長性狀在種源和無性系水平上存在明顯差異，生長性狀在早期和成熟期有一定相關(guān)性，其中無性系水平上的相關(guān)性更強(qiáng)，生長性狀與木材品質(zhì)、形質(zhì)性狀間相關(guān)性沒有明顯的規(guī)律。李上前等[22]測定分析了柳杉一代種子園 5 年生家系的子代林樹高、胸徑、材積和冠幅等生長性狀，結(jié)果表明家系內(nèi)生長性狀的變異系數(shù)大于家系間，家系間胸徑、樹高、材積存在極顯著差異，冠幅差異不顯著。Murai[5]通過表型性狀對不同地理分布的日本柳杉天然林的遺傳變異進(jìn)行研究，結(jié)果表明日本柳杉可分為兩個生態(tài)性(或品系)，即 ura-sugi(C.japonicavar.radicans，日本海沿岸)和 omote-sugi(C.japonica，太平洋沿岸)。這與Yasue等[23]通過日本柳杉二萜類生化成分分析結(jié)果一致。

2.2 分子遺傳變異

分子標(biāo)記有蛋白質(zhì)大分子和DNA標(biāo)記兩種類型，已被廣泛用于植物學(xué)研究。Tsumura等[24]采用聚丙烯酰胺垂直平板凝膠電泳技術(shù)，建立了日本柳杉同工酶變異檢測方法。較多同工酶標(biāo)記研究[25～28]結(jié)果表明，日本柳杉保存有中等程度的遺傳變異，遺傳變異主要存在于群體內(nèi)，群體間遺傳變異相對較小。Taira[29]利用同工酶標(biāo)記研究日本柳杉天然林的更新模式與遺傳多樣性的關(guān)系。結(jié)果表明，海拔 1 750 m以上日本柳杉僅通過壓條繁殖，遺傳多樣性較低，海拔1550 m以下的群體通過幼苗繁殖和壓條繁殖，遺傳多樣性豐富。

DNA分子標(biāo)記能直接反映基因組DNA的差異[30]，不受環(huán)境和人為干擾的影響，具有快速、高效、多態(tài)性好的特點(diǎn)，能提供比表型和譜系分析更準(zhǔn)確的評價信息[31]，被廣泛應(yīng)用于柳杉種質(zhì)資源親緣關(guān)系、品種鑒定和群體遺傳學(xué)研究。Takata等[32]利用RAPD標(biāo)記對由84個品種扦插獲得的549個個體進(jìn)行了鑒別，53個品種的DNA指紋圖譜間無差別，另外31個品種的基因型有所差異。駱鵬等[33]利用SSR標(biāo)記分析了89 個柳杉無性系的遺傳多樣性，結(jié)果表明柳杉的遺傳多態(tài)性處于中等偏高水平，根據(jù)構(gòu)建的指紋圖譜以及個體間的遺傳距離將柳杉 89 個無性系分為 5 大類。張景麗等[34]通過開發(fā)的 EST-SSR 標(biāo)記對收集的浙江和福建共49 個柳杉優(yōu)良無性系進(jìn)行遺傳多樣性分析。聚類結(jié)果表明，福建的柳杉資源的親緣關(guān)系相對較獨(dú)立，而浙江的無性系親緣關(guān)系相對較近。

柳杉群體遺傳學(xué)研究方面，Tsumura等[35]對11個日本柳杉天然群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析，多態(tài)性STS標(biāo)記結(jié)果與原等位酶結(jié)果一致且優(yōu)于等位酶結(jié)果，可用于日本柳杉的群體遺傳學(xué)和基因定位。Shimizu 等[36]利用RAPD標(biāo)記方法研究日本西部京都地區(qū)日本柳杉的遺傳變異，表明日本柳杉種群內(nèi)遺傳多樣性高于種群間。徐進(jìn)等[37]采用 SSR標(biāo)記對柳杉初級種子園 12 個種源地共96株優(yōu)良無性系進(jìn)行遺傳多樣性分析，26 對 SSR分子標(biāo)記共擴(kuò)增得到 103個多態(tài)位點(diǎn)，平均觀察雜合度為 0.496 6，Shannon 信息指數(shù)的平均值為 0.994 5，Nei多樣性指數(shù)的平均值為 0.533 6，表明該柳杉初級種子園具有較高的遺傳多樣性水平。Uchiyama 等[38]利用4896個SNP標(biāo)記對510株日本柳杉核心種質(zhì)進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)和全基因組連鎖不平衡(LD)研究，貝葉斯聚類和主坐標(biāo)分析將樣本細(xì)分為與日本海側(cè)和太平洋沿岸相對應(yīng)的兩個不同的群體，與表型和二萜成分分析結(jié)果一致[5,23]。

3 柳杉遺傳育種研究

3.1 種子園傳統(tǒng)育種

柳杉育種多利用種子園方式選育優(yōu)良家系、無性系或品種，為人工林栽培提供大量的種子。我國于1974年開展柳杉優(yōu)樹選擇。福建省霞浦縣楊梅嶺林場調(diào)查了66 hm2以上的柳杉，初選優(yōu)樹74株，通過復(fù)查淘汰，保存12株，提出了柳杉選優(yōu)標(biāo)準(zhǔn)與方法[39]。黃信金[20]等通過種源試驗(yàn)，選育了福建楊梅嶺、羅源西蘭、江西廬山等優(yōu)良種源 13 個，又從40個柳杉半同胞子代中選育出生長量大、木材品質(zhì)好的優(yōu)良家系12個[19]。歐陽磊[21]對32年生柳杉種子園親本進(jìn)行綜合比較，選擇出柳杉優(yōu)良親本18個。謝巧銀[40]對柳杉種源造林試驗(yàn)研究，篩選出適應(yīng)性，抗逆性強(qiáng)且生長量大的優(yōu)良種源4 個。日本柳杉的育種早于我國，始于20世紀(jì)50年代。目前，日本柳杉分布區(qū)各縣都建有種質(zhì)資源圃和種子園，全國已選育得到3600個初代精英樹，146個二代優(yōu)樹[41]。建立了普通無性系種子園和小型種子園[42～43]，小型種子園勞動力需求量小，育種效率高，種子產(chǎn)量高，相關(guān)技術(shù)已在日本國內(nèi)得到廣泛推廣。

雜交育種是優(yōu)良品種選育的重要方法。張景麗等[34]通過遺傳聚類分析獲得23份優(yōu)選柳杉親本，選配2個無性系作為父本，以姥山林場5個優(yōu)良無性系為母本，各雜交組合都已得到子代種子。近年來，日本育種學(xué)家通過室內(nèi)微型種子園，以盆栽柳杉材料進(jìn)行雄性不育品種選育[44～45]。Saito等[46]將雄性不育突變株與優(yōu)樹無性系進(jìn)行雜交，得到雄性不育的雜合子品種Ohara13，檢測結(jié)果表明該雜交子代中，優(yōu)良雄性不育苗的比例可達(dá)到47.3%[45]。

3.2 分子標(biāo)記輔助選擇育種( Marker Assisted Selection, MAS)

日本柳杉的分子標(biāo)記輔助育種研究起步早，研究工作深入，包括MAS聚合育種和QTL-MAS(Quantitative Trait Loci Mapping, MAS)育種兩種方式。MAS聚合育種主要應(yīng)用于日本柳杉花粉稀少品種的選育，Moriguchi等[47]在日本柳杉雄性不育基因定位與克隆的基礎(chǔ)上，提出了一種利用與雄性不育基因座密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，通過這種方法可高效選擇具有多個雄性不育基因的優(yōu)良個體。Tadama等通過246個SNP標(biāo)記測定15個雄性不育種質(zhì)間的遺傳距離，評估其子代育種效率(通訊交流)，研究結(jié)果能為雜交育種的親本選配提供理論依據(jù)。

QTL-MAS育種是通過構(gòu)建的遺傳圖譜檢測數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)，以得到最緊密連鎖的分子標(biāo)記來定位目標(biāo)基因組。Mukai等[48]所構(gòu)建的日本柳杉遺傳連鎖圖譜包含72個RFLP、11個RAPD、1個同工酶和1個形態(tài)標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上，Yoshimaru等[49]對日本柳杉幼齡期生長及開花生根能力進(jìn)行分析，在遺傳圖譜的不同位置檢測到與雌雄開花相關(guān)的QTL，并表現(xiàn)出不同的遺傳效應(yīng)，表明控制雌雄開花的遺傳系統(tǒng)是不同的。同樣，Ujino-Ihara等[50]在Yoshimaru等[49]獲得的QTL同源區(qū)域，發(fā)現(xiàn)一個自然條件下與日本柳杉雄球花豐度穩(wěn)定相關(guān)QTL位點(diǎn)。Kuramoto等[51]根據(jù)所構(gòu)建的遺傳圖譜(包含177個RAPD標(biāo)記)檢測到與木材強(qiáng)度和密度相關(guān)的QTLs位點(diǎn)。Moriguchi等[52]構(gòu)建了以968個SNP為主的 1 262個標(biāo)記(兩個相鄰標(biāo)記間平均距離為1.1 cM)的高密度連鎖圖譜，并在第九連鎖群上定位了一個主要的雄性不育基因(ms1)，ms1基因與最近標(biāo)記之間的圖譜距離僅為0.5 cM。另一個家系中的雄性不育基因(ms2)定位于第五連鎖群上，ms2基因與最近標(biāo)記的圖譜距離為1.6 cM[53]。雄性不育基因的定位成功為日本柳杉花粉稀少品種的分子育種提供了可能。

4 問題與展望

相比較而言，柳杉作為日本的“國樹”，其天然資源不僅得到了很好的保護(hù)，而且建立了眾多種質(zhì)資源圃，有系統(tǒng)、完整的柳杉優(yōu)樹選擇、種源選擇標(biāo)準(zhǔn)和育種體系。同時，日本學(xué)者在柳杉群體分布、分子遺傳學(xué)以及遺傳育種等方面有較深入的研究。而我國雖然柳杉遺傳資源豐富，但質(zhì)量不高，木材市場供需矛盾突出，現(xiàn)有的柳杉研究工作還存在很大的不足和滯后性。對現(xiàn)有資源保護(hù)不夠，資源利用率低，育種進(jìn)程緩慢，育種效率低，進(jìn)一步限制了我國柳杉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

今后的研究工作中，應(yīng)注重開展我國廣域分布柳杉資源的調(diào)查和遺傳多樣性評價研究，結(jié)合日本柳杉的優(yōu)樹選擇標(biāo)準(zhǔn)和雄性不育品種高精度鑒別技術(shù)，從我國豐富的柳杉遺傳資源中篩選、鑒定、收集優(yōu)良株系和特異種質(zhì)(如雄性不育種質(zhì))，為柳杉資源保護(hù)和育種提供科學(xué)依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，將傳統(tǒng)育種方法與生物技術(shù)相結(jié)合，高效選育柳杉優(yōu)良品種，加快良種苗木的繁育，提高柳杉用材林生產(chǎn)效益，滿足不斷增長的木材需求。