蛋白質(zhì)組學(xué)在魚肉品質(zhì)研究中的應(yīng)用

王 琨

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150028）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，人類對(duì)動(dòng)物蛋白的消費(fèi)需求呈上升趨勢(shì)，同時(shí)也對(duì)食物品質(zhì)提出了更高的要求。作為富含較高蛋白質(zhì)的魚類已成為人類飲食中可獲得的極其重要的蛋白質(zhì)來(lái)源，其品質(zhì)的研究也成為了近幾年國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。在魚類中，最好的品質(zhì)是緊實(shí)且具有良好水分保持能力的肉質(zhì)，這些性狀主要是由機(jī)體蛋白質(zhì)的本質(zhì)和屬性決定的。食品基質(zhì)的構(gòu)建，無(wú)論是在細(xì)胞和組織范圍內(nèi)，都是由蛋白質(zhì)調(diào)控的[1]。因此，需要可靠的技術(shù)分析水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)，以提高水產(chǎn)品品質(zhì)。隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以在蛋白質(zhì)水平上篩選出與肉質(zhì)有關(guān)的標(biāo)記蛋白，為探索肉類品質(zhì)形成的影響因素提供了新的研究視角。雖然，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用仍處于初級(jí)階段，其進(jìn)展將比基因組測(cè)序速度慢，但已經(jīng)展現(xiàn)較好的前景。本文對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的定義、“經(jīng)典”研究方法以及在魚肉品質(zhì)研究的應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)要綜述，以期為今后魚類肉質(zhì)改良提供參考。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)

蛋白質(zhì)組（Proteome）的概念最先由Marc Wilkins提出，指由一個(gè)基因組表達(dá)的所有蛋白質(zhì)[2]。與基因組不同的是，蛋白質(zhì)易受環(huán)境影響，也隨時(shí)間的變化在組織中各不相同，具有動(dòng)態(tài)性[3]。目前認(rèn)為是蛋白質(zhì)組是特定時(shí)刻已知細(xì)胞、組織或者器官所有的蛋白質(zhì)（包括亞型和修飾蛋白質(zhì)）[4]。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)的目標(biāo)是通過(guò)了解蛋白質(zhì)性質(zhì)、功能、相互作用和聯(lián)系及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，最終從生物體生理特點(diǎn)解釋遺傳與環(huán)境如何影響生物功能。

二維凝膠電泳（2-DE）是最廣泛使用的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，因?yàn)槠浜?jiǎn)單、可靠，而且相對(duì)實(shí)惠。該技術(shù)是基于蛋白質(zhì)等電聚焦（IEF）和相對(duì)分子質(zhì)量不同進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，可一次分離出數(shù)百甚至上千種蛋白質(zhì)[5]。這種技術(shù)分辨率高，對(duì)未經(jīng)處理的樣品耐受性好，可以在一個(gè)特性的細(xì)胞或組織中分離出更多的蛋白質(zhì)點(diǎn)，使其成為可靠的最佳實(shí)驗(yàn)工具之一。因此，其適合全面分析器官中蛋白質(zhì)的表達(dá)。然而2-DE也有一些缺點(diǎn)，例如不能將復(fù)雜（組織）樣本中的所有蛋白質(zhì)可視化，一些低豐度的蛋白不易檢測(cè)，其中包括許多關(guān)鍵細(xì)胞信號(hào)元件和轉(zhuǎn)錄因子，凝膠回收率不穩(wěn)定，并且這種方法也是凝膠蛋白組學(xué)技術(shù)以填補(bǔ)2-DE留下的空白或完全消除凝膠技術(shù)（包括酵母雙雜交和反向雜交兩種測(cè)定法）以及同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù)、噬菌體抗體庫(kù)、蛋白質(zhì)微陣列和多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)等方法[6-11]。上述方法不僅克服2D電泳的部分缺點(diǎn)，還具備以下優(yōu)點(diǎn)：大規(guī)模蛋白表達(dá)和描述，消除蛋白質(zhì)分離過(guò)程中耗時(shí)的步驟，高靈敏度和小樣本量的要求及肽分離的通用機(jī)制。然而，這些技術(shù)的改進(jìn)和相關(guān)過(guò)程目前仍存在局限性，對(duì)未來(lái)仍是一個(gè)挑戰(zhàn)[12]。因此，2-DE技術(shù)仍然在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。

質(zhì)譜法在生命科學(xué)中被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析，在蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用2-DE等分離技術(shù)后，在蛋白質(zhì)的高通量識(shí)別鑒定起到重要作用[13]。質(zhì)譜儀包括3個(gè)基本組成成分（離子源、質(zhì)量分析儀和離子探測(cè)器），具有極高的靈敏度。20世紀(jì)80年代末，研究人員采用基質(zhì)輔助激光電離（MALDI）和電噴霧電離（ES）這兩種軟電離技術(shù)應(yīng)用到蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析中，推動(dòng)了生物質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展[14]。事實(shí)上，基于質(zhì)譜技術(shù)（MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)之一，根據(jù)Guerrera等的說(shuō)法，MS是幾乎所有蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)的核心，因?yàn)槠涮峁┝说鞍踪|(zhì)分析的關(guān)鍵工具——其獨(dú)特的重量，但對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，不是整個(gè)蛋白質(zhì)的質(zhì)量，而是由酶分解產(chǎn)生的肽的質(zhì)量[15]。因此，質(zhì)譜分析技術(shù)仍有一定的缺點(diǎn)，比如不能區(qū)分幾種特殊氨基酸，有些固有序列不能測(cè)定等。隨著基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，高通量鑒定蛋白質(zhì)相對(duì)定量已經(jīng)成為可能，復(fù)雜混合物中單個(gè)肽的絕對(duì)定量已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)，高度修飾后的蛋白質(zhì)可以完全進(jìn)行質(zhì)譜分析[16-18]。然而，在今后蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中，仍然面臨著諸多挑戰(zhàn)，尤其是在復(fù)雜的樣品研究中的靈敏度提升、整個(gè)蛋白質(zhì)測(cè)定的新方法、動(dòng)態(tài)顯示和檢測(cè)蛋白質(zhì)的范圍等。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在魚肉品質(zhì)研究中的應(yīng)用

與其他食品相比，魚類質(zhì)量評(píng)估受到越來(lái)越多的關(guān)注和更多的研究。將蛋白質(zhì)組技術(shù)應(yīng)用于魚肉品質(zhì)研究的主要目標(biāo)是獲取魚肉品質(zhì)變化中蛋白質(zhì)的作用機(jī)制，從全新的角度來(lái)分析與肉質(zhì)相關(guān)的問(wèn)題，有望達(dá)到改良肉質(zhì)的目的[19]。一般來(lái)說(shuō)，魚類肉質(zhì)除了由遺傳因素決定，還受“魚類福利”、食物組成與營(yíng)養(yǎng)水平及死后加工方式、貯存溫度等多因素影響。但無(wú)論何種因素，最終都是取決于肌肉組織自身的生化代謝改變結(jié)構(gòu)特性，如嫩度、多汁性、肌內(nèi)脂肪含量和肌纖維特性[20]。

2.1 “魚類福利”影響

魚類福利可通過(guò)表觀、生長(zhǎng)狀態(tài)、應(yīng)激反應(yīng)、動(dòng)物行為和死亡率等生理指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)。許多學(xué)者研究認(rèn)為，當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變或受到壓力等影響，魚類會(huì)出現(xiàn)繁殖能力下降、生長(zhǎng)周期變長(zhǎng)，甚至死亡率上升等變化。從這個(gè)意義上講，“魚類福利”可以直接影響魚類在生長(zhǎng)期間的質(zhì)量。Veiseth-Ken在受到40 min擁擠壓力的大西洋鮭Salmo salar肌肉中發(fā)現(xiàn)了27個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，包括結(jié)構(gòu)蛋白（即原肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、重鏈肌球蛋白和輕鏈肌球蛋白）和肌質(zhì)蛋白[21]。另一方面，大西洋鮭血漿載脂蛋白AI降低，血管緊張素原補(bǔ)體成分C3含量增高，所有這些蛋白質(zhì)都參與不同的二級(jí)和三級(jí)應(yīng)激反應(yīng)，改變能量代謝，滲透調(diào)節(jié)和免疫功能，這種變化不僅與魚類的生理應(yīng)激反應(yīng)相對(duì)應(yīng)，還導(dǎo)致肌肉pH下降，從而影響水產(chǎn)制品品質(zhì)變化。Morzel等研究了兩種不同的屠宰程序，以宰殺前15 min高密度聚集與對(duì)照組相比，研究虹鱒肌肉蛋白質(zhì)的變化，在試驗(yàn)過(guò)程中，使用雙向電泳分離蛋白質(zhì)，并通過(guò)MALDI-TOF光譜法鑒定目標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在死后45 min和24 h分別在兩組魚之間差異地顯示了29和4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，鑒定出的蛋白質(zhì)點(diǎn)主要對(duì)應(yīng)于能量產(chǎn)生途徑（磷酸丙糖異構(gòu)酶、烯醇酶、丙酮酸脫氫酶）或結(jié)構(gòu)蛋白（結(jié)蛋白、cap-Z、肌球蛋白重鏈片段）中涉及的蛋白質(zhì)[22]。因此，魚類在宰殺前受到強(qiáng)烈肌肉活動(dòng)對(duì)魚的肌肉完整性及質(zhì)構(gòu)特性也會(huì)產(chǎn)生不良影響。王彥波等研究不同宰殺方式對(duì)鯽魚肌肉質(zhì)構(gòu)和蛋白質(zhì)組的影響，結(jié)果表明，致死方式影響鯽魚肌肉中蛋白質(zhì)的含量與代謝，表現(xiàn)為肌肉的硬度、咀嚼性和膠黏性等質(zhì)構(gòu)指標(biāo)發(fā)生變化[23]。此外，魚類生長(zhǎng)環(huán)境的不同也會(huì)對(duì)魚類的感官和質(zhì)構(gòu)特性產(chǎn)生較大的影響，這在一些研究中也得到證實(shí)[24-26]。由此可見，利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究有肉質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)的表征及動(dòng)態(tài)變化，易于從分子水平上揭示“魚類福利”對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物品質(zhì)影響機(jī)制，為魚類養(yǎng)殖環(huán)境的優(yōu)化提供理論依據(jù)。

2.2 飼料組成

毫無(wú)疑問(wèn)，魚體肌肉營(yíng)養(yǎng)成分是衡量魚肉質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是消費(fèi)者關(guān)注的問(wèn)題。影響魚類肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的主要因素是飼料，飼料的組成成分會(huì)對(duì)機(jī)體成分產(chǎn)生一定的影響。當(dāng)魚類食用某些有異味物質(zhì)的飼料，在肌肉中的殘留達(dá)到一定濃度時(shí)，就會(huì)影響魚類肉質(zhì)的風(fēng)味。蛋白質(zhì)組學(xué)在研究飼料成分對(duì)魚類代謝影響方面發(fā)揮重要作用。Rufino等通過(guò)研究分析在魚類養(yǎng)殖過(guò)程中加入飼料添加劑山楂酸與對(duì)照組比較的金頭鯛幼魚的肝臟中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)信息，結(jié)果表明，飼料添加劑可刺激魚類的生長(zhǎng)，影響魚肉的質(zhì)量[27]。Martin等使用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究虹鱒肝臟的蛋白質(zhì)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，飼喂不同日糧的魚的蛋白質(zhì)生長(zhǎng)率沒(méi)有差異；然而，飼喂大豆蛋白質(zhì)越多，魚的蛋白質(zhì)消耗越快而結(jié)構(gòu)蛋白合成效率較低，氨的排泄增加以及肝谷氨酸脫氫酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ASAT）的活性增加，導(dǎo)致虹鱒的代謝變化，影響魚肉的品質(zhì)[28]。

2.3 死后代謝機(jī)制

魚類死后的加工方式和貯藏會(huì)影響肉質(zhì)，魚肉產(chǎn)品貯藏加工過(guò)程中由于蛋白水解導(dǎo)致質(zhì)構(gòu)特性發(fā)生改變，肉質(zhì)變軟，同時(shí)伴有細(xì)菌腐敗，最終影響水產(chǎn)品品質(zhì)。很多研究表明，鈣蛋白酶和組織蛋白酶降解肌原纖維，基質(zhì)金屬蛋白酶和基質(zhì)絲氨酸對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，這些生化反應(yīng)發(fā)生的過(guò)程被認(rèn)為是肉質(zhì)變化的主要原因之一，然而該過(guò)程更多的細(xì)節(jié)仍然未知。Kjaersgard等利用2-DE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與新鮮的鱈魚比較，死后鱈魚肌肉有11個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度發(fā)生了變化，其中8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度顯著增加，分析表明這些蛋白質(zhì)點(diǎn)是肌肉組織的部分分解產(chǎn)物。還發(fā)現(xiàn)，有11個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的豐度發(fā)生顯著變化，其中9個(gè)蛋白質(zhì)強(qiáng)度增加，并且對(duì)于其中8個(gè)，在死后的前2 h內(nèi)增加顯著（P＜0.05）[30]。相反，強(qiáng)度降低的兩個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在8 d后顯示顯著變化（P＜0.05），從而表明在魚類死魚肉生化反應(yīng)過(guò)程是由蛋白質(zhì)變化導(dǎo)致。因此，應(yīng)用基于2-DE的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的對(duì)于更深入的研究魚類死亡后新陳代謝分子機(jī)制與肉質(zhì)變化之間的關(guān)聯(lián)性具有重要價(jià)值。

3 研究展望

以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為手段對(duì)水產(chǎn)品品質(zhì)的研究報(bào)道逐年增加，但在實(shí)際的水產(chǎn)養(yǎng)殖中，蛋白質(zhì)組學(xué)還是沒(méi)有得到更廣泛的應(yīng)用[31-32]。尤其是什么方法最適合于魚類樣品的蛋白質(zhì)組分析，如何驗(yàn)證不同實(shí)驗(yàn)室使用現(xiàn)有技術(shù)確定的相關(guān)結(jié)果，以及蛋白質(zhì)表達(dá)變化的預(yù)測(cè)因子等方面仍有很大的研究空間。未來(lái)，各種操作簡(jiǎn)便、靈敏性高等更具成本效益技術(shù)的發(fā)展，將進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的價(jià)值，在水產(chǎn)動(dòng)物研究中扮演越來(lái)與重要的角色[33]。隨著魚類蛋白質(zhì)組信息數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷增加，同時(shí)與其他學(xué)科加強(qiáng)合作，包括生理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)，以及水產(chǎn)養(yǎng)殖和食品工業(yè)等，必將為在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域改進(jìn)、增加甚至創(chuàng)造相關(guān)產(chǎn)品提供新機(jī)遇。