雙孢蘑菇育種技術(shù)研究進展*

李正鵬 李文 李巧珍 陳明杰 黃建春 王金斌

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學院，上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點開放實驗室，上海 奉賢 201403；2.國家食用菌工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室，上海 奉賢 201403）

雙孢蘑菇屬于真菌門（Eumycota）擔子菌綱（Basidiomycetetes）傘菌目（Agaricales）蘑菇科（Agaricaceae）蘑菇屬（Agaricus）[1～2]，在100多個國家廣泛栽培，素有世界菇之稱，在全球食用菌產(chǎn)業(yè)中占有重要地位。雙孢蘑菇的生活史屬二級性次級同宗配合遺傳方式，雙孢擔子占絕大部分，單個擔孢子在條件適宜時可萌發(fā)并完成營養(yǎng)積累，產(chǎn)生原基，發(fā)育子實體，散射成熟擔孢子，完成整個生活史[3～4]。雙孢蘑菇在我國基本上實現(xiàn)了設(shè)施化和工廠化生產(chǎn)，但工廠化栽培所使用的雙孢蘑菇菌種卻嚴重依賴國外進口，因此，我國應(yīng)加快開展適宜工廠化栽培且具有自主知識產(chǎn)權(quán)的優(yōu)質(zhì)雙孢蘑菇菌種的培育工作。本文介紹了雙孢蘑菇的6種育種方法，以期為我國的雙孢蘑菇育種工作提供理論依據(jù)。

1 自然選種

自然選種[5]也叫選擇育種，是一種不斷去劣存優(yōu)的菌種篩選方法，目標是獲得有益的突變菌株。1894年，雙孢蘑菇純菌種首次育成[6]。1929年，國外學者公開了利用雙孢蘑菇組織和孢子制種的方法，包括雙孢蘑菇孢子萌發(fā)形成菌絲體并產(chǎn)生子實體的培育過程[7]。索米塞爾菌株（1948，法國）及白色、棕色和奶油色等蘑菇菌株（1950，美國）都是通過人工自然選種獲得的[5～9]。20世紀80年代以前，我國缺乏雙孢蘑菇種質(zhì)資源，栽培品種（如S176）主要從國外引進經(jīng)人工自然選育而成[9]。但是自然選種具有其局限性，因菌株沒有基因重組，在遺傳上變異性很小，很難獲得性狀改良明顯的變異株。

2 孢子分離育種[10]

Sinden采用多孢篩選法獲得雙孢蘑菇A6菌株[11]。多孢篩選法的局限性在于菌種在遺傳背景上的均一性大于變異性，不能有效組合優(yōu)勢性狀，難以獲得優(yōu)良的變異株。相對于多孢篩選法，單孢分離篩選法雖然費時，但獲得性狀改良明顯的雙孢蘑菇新菌株的幾率更大[12～13]。閩一號菌株就是通過分離孢子獲得的菌株，因表現(xiàn)較好而被廣泛應(yīng)用[14]。通過多孢分離和單孢分離選種方法雖然篩選出了許多菌株，但這些菌株存在高產(chǎn)的菌株常常不優(yōu)質(zhì)、優(yōu)質(zhì)的菌株常常不高產(chǎn)的問題[14]。

3 雜交育種[12～13，15～21]

雙孢蘑菇經(jīng)過減數(shù)分裂產(chǎn)生有性孢子，通過有性雜交可獲得綜合雙親優(yōu)良性狀的新品種[22]。目前，國內(nèi)外育種工作主要根據(jù)雙孢蘑菇同核不育菌株配對雜交定向育種的方法進行雙孢蘑菇品種改良。20世紀70年代，國外學者利用純白色和米色蘑菇品種不育單孢子進行雜交配對，以恢復(fù)結(jié)實性為篩選標記，選育出雜交菌株U1和U3[23]。我國從20世紀80年代初開始開展雙孢蘑菇雜交育種工作。福建省農(nóng)科院食用菌研究所、上海市農(nóng)科院食用菌研究所等6家單位在國家蘑菇攻關(guān)項目的支持下，從1986年開始開展跨地域的技術(shù)合作，歷時25年，建立了單孢配對雜交、分子標記輔助雙孢蘑菇育種、同核體篩選鑒別、雜交異核體快速鑒定等技術(shù)體系，用以分析菌株間的定向篩選目標新菌株、預(yù)測新菌株特性、跟蹤子代遺傳與變異、鑒定雜交和親緣關(guān)系、鑒定菌株的基因型、推定同核體不育株[17～21]。1989年，我國利用該方法[17]成功選育出第1個具有自主知識產(chǎn)權(quán)的雙孢蘑菇雜交品種As2796。廖劍華應(yīng)用來源于菌株As2796同核不育菌株進行配對回交，篩選出適合工廠化栽培的新菌株W192，該菌株使雙孢蘑菇的平均單產(chǎn)提高了20%～25%[24]。

雙孢蘑菇同核不育單孢配對雜交育種法著眼于雜交菌株間的性狀優(yōu)勢互補，其目的性比較明確，但該方法在雙孢蘑菇育種中存在幾個問題。（1）雙孢蘑菇獨特的雙孢擔子難以獲得用于雜交的同核孢子；（2）菌絲體不發(fā)生鎖狀聯(lián)合現(xiàn)象，難以快速區(qū)分異核體與同核體菌絲，且單孢分離萌發(fā)率低[5～9，17～24]；（3）尚未發(fā)現(xiàn)與重要性狀相關(guān)的遺傳標記，缺乏定向育種的跟蹤標記，產(chǎn)生的雜交菌種并不都具備親本的優(yōu)良性狀[25～26]；（4）單孢分離操作繁瑣，染菌率高[27]。

4 原生質(zhì)體育種

原生質(zhì)體育種包括原生質(zhì)體單核化和原生質(zhì)體融合兩項技術(shù)。原生質(zhì)體單核化可以獲得食用菌遺傳育種單單雜交和單雙雜交過程中十分重要的基礎(chǔ)材料。單核化雜交育種可極大減少篩選雜交次數(shù)、縮短育種周期、拓寬育種范圍等[28]。單核雜交技術(shù)主要存在同核原生質(zhì)體的再生率和獲得同核體的比例很低等問題。Wessels[29]采用特殊的溶壁酶體系和穩(wěn)定劑使雙孢蘑菇原生質(zhì)體再生率達到了30%以上。馬愛民[19]從不同來源的雙孢蘑菇菌株中獲得同核原生質(zhì)體的同核率達到了15%。

原生質(zhì)體融合[30]是指在促融劑作用下對遺傳性狀不同的兩個原生質(zhì)體進行融合，借以獲得兼有雙親優(yōu)良遺傳性狀的穩(wěn)定的重組子的過程。首先研究雙孢蘑菇原生質(zhì)體的制備與再生、同核體的分離與鑒定等[19]，進而研究同核原生質(zhì)體親和性反應(yīng)及雜交異核體F2代的農(nóng)藝性狀分離與變異規(guī)律，建立以菌落形態(tài)、菌絲生長速度、羧甲基纖維素酶相對活性以及酯酶同工酶電泳為手段的雜交異核體的鑒定體系[31]。黎雪等利用原生質(zhì)體融合技術(shù)以雙孢蘑菇品種浙農(nóng)1號和As2796為親本，獲得新菌株Z-3和Z-7，產(chǎn)量分別較As2796提高12.5%和5.1%[32]。與常規(guī)雜交相比，該項技術(shù)主要有以下優(yōu)勢：原生質(zhì)體融合不受物種屬種的限制，可發(fā)生在物種內(nèi)，也可發(fā)生在物種之間或?qū)僦g；因為沒有細胞壁，細胞融合和細胞基因重組的概率較高；對于親本菌株，無需特殊的遺傳標記。但是原生質(zhì)體融合的融合子篩選較為復(fù)雜。目前，原生質(zhì)體育種技術(shù)路線主要有兩種，一是利用同核單孢雜交野生菌株與商業(yè)菌株選育抗性較強或性狀優(yōu)良的生產(chǎn)品種，二是利用原生質(zhì)體作為受體細胞，將DNA片段插入到細胞中，轉(zhuǎn)化育種可定向改造蘑菇基因，通過有效的篩選標記方法獲得目的菌株。

5 基因工程育種

基因工程育種是一種在分子水平上的育種技術(shù)。該技術(shù)是通過基因工程的手段對基因組進行改造，主要包括目的基因與載體的構(gòu)建，原生質(zhì)體制備、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)或DNA分子雜交技術(shù)，目的基因在受體細胞穩(wěn)定表達并穩(wěn)定遺傳，獲得新菌株。該方法于1991年首次被提出[33～34]，并于1996年首次建立了轉(zhuǎn)化體系，為雙孢蘑菇的遺傳轉(zhuǎn)化工作奠定了基礎(chǔ)[35]。研究人員利用該技術(shù)成功獲得外源基因穩(wěn)定遺傳表達的轉(zhuǎn)基因新菌株，包括應(yīng)用反義RNA技術(shù)抑制酪氨酸酶活性，獲得了不易褐變的雙孢蘑菇轉(zhuǎn)基因菌株，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化雙孢蘑菇子實體等?；蚬こ痰挠N方法使得雙孢蘑菇外源基因轉(zhuǎn)化效率大幅度提高，極大推進了雙孢蘑菇乃至整個食用菌領(lǐng)域的基因工程研究[36～38]。

6 誘變育種

誘變育種就是采用化學方法、物理方法等制造突變，再綜合篩選獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、適應(yīng)性強的目的菌株，誘變材料可以為孢子或原生質(zhì)體。應(yīng)用該方法育種，菌株的遺傳突變幾率大大提高。但誘變菌株在經(jīng)歷誘變的過程中其遺傳基因也可能改變，且有益突變很少，因此利用誘變獲得的食用菌高產(chǎn)菌株很少。在食用菌的誘變育種中常使用60Co-Y射線、紫外線、離子束、超聲波、X射線、快中子、激光、亞硝酸、亞硝酸胍、硫酸二已酯、氮芥等，可根據(jù)菌種的特點和實驗條件選擇不同的誘變劑[39～40]。但雙孢蘑菇育種很少采用誘變育種法。李前紅采用60Co-Y射線誘變處理菌株As2796孢子，結(jié)合同工酶標記、RAPD標記、ISSR標記以及出菇實驗，獲得了3株品質(zhì)好且產(chǎn)量高的雙孢蘑菇菌株[41]。

雙孢蘑菇的育種目標主要有：（1）獲得適宜不同基質(zhì)且利用率高、產(chǎn)量高、質(zhì)量好的菌株；（2）改良雙孢蘑菇的抗病基因，提高雙孢蘑菇的抗病能力，選育出抗性（抗蟲、抗病和耐熱等）強的新品種；（3）改良雙孢蘑菇褐變基因，延長雙孢蘑菇貨架期。目前，雙孢蘑菇商業(yè)菌種主要來源于U系列或AS2796系列的后代，如A15、W192等菌株[14]。雙孢蘑菇新品種的獲得，需建立在進一步研究遺傳背景、確定優(yōu)良性狀、確定有穩(wěn)定遺傳的生物學標記的基礎(chǔ)上，從而建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系。