紅球菌跨膜運(yùn)輸熒蒽的差異膜蛋白分析

孔德康,李 藝,王紅旗*,許 潔,關(guān)晶晶

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紅球菌跨膜運(yùn)輸熒蒽的差異膜蛋白分析

孔德康1,李 藝2*,王紅旗1*,許 潔1,關(guān)晶晶1

(1.北京師范大學(xué)水科學(xué)研究院,北京 100875；2.廣西師范大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院,廣西 桂林 541004)

提取不同時間熒蒽誘導(dǎo)下紅球菌BAP-1分泌的膜蛋白,利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)(iTRAQ技術(shù))結(jié)合液相二級質(zhì)譜對差異膜蛋白進(jìn)行聚類以及生物信息學(xué)分析.旨在從蛋白質(zhì)層面上研究紅球菌BAP-1跨膜運(yùn)輸熒蒽過程中起關(guān)鍵作用的膜蛋白種類及其作用機(jī)制.結(jié)果共鑒定到172個差異膜蛋白.通過差異膜蛋白的COG和GO功能分析,發(fā)現(xiàn)熒蒽的加入主要影響了紅球菌BAP-1細(xì)胞膜上與能量、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的膜蛋白.ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和TonB依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為微生物主要的載體蛋白對BAP-1跨膜運(yùn)輸熒蒽起到了重要作用.過氧化氫酶和超氧化物歧化酶在第6d有一個顯著上調(diào),作為抗氧化防御機(jī)制來保護(hù)微生物.各種膜蛋白在不同階段發(fā)揮著各自作用,這些蛋白共同組成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)調(diào)控紅球菌BAP-1的跨膜運(yùn)輸過程.

紅球菌BAP-1；熒蒽；膜蛋白；跨膜運(yùn)輸；iTRAQ

多環(huán)芳烴(PAHs)因?yàn)槠洹叭隆毙?yīng)以及穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)對人類和生態(tài)環(huán)境造成了極大的影響.PAHs的水溶性差,通過自然衰減或者物理化學(xué)去除工藝的方法往往收效甚微.生物降解已經(jīng)被證實(shí)是最經(jīng)濟(jì)、最環(huán)保的PAHs修復(fù)方法[1].紅球菌是一種典型的PAHs降解菌,可以有效的降解萘、菲、熒蒽等PAHs[2-3].

細(xì)胞膜是防止細(xì)胞外物質(zhì)自由進(jìn)入細(xì)胞的屏障,是保證細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性和各種生化反應(yīng)有序運(yùn)行的重要細(xì)胞器.細(xì)胞膜的穩(wěn)定性是細(xì)菌提高細(xì)胞活力和生長的關(guān)鍵,研究表明,微生物膜能產(chǎn)生一些物質(zhì)(如肽基脯氨酰異構(gòu)酶)來維持膜的穩(wěn)定性[4].我們的前期研究表明,在微生物成功的對PAHs進(jìn)行吸附攝取后,PAHs需要通過微生物的細(xì)胞膜跨膜運(yùn)輸進(jìn)入到細(xì)胞體內(nèi).此時,微生物才能對PAHs進(jìn)行降解[5].細(xì)胞膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)(例如H+)可以為PAHs的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供動力,從而提高微生物對PAHs的攝取和降解能力[4].并且,微生物細(xì)胞膜上有許多酶活性位點(diǎn),可以與PAHs或其他底物結(jié)合,從而將這些物質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中.但是,細(xì)胞膜的狀態(tài)會隨著外界環(huán)境的不同而變化,其疏水性和滲透性的變化會影響微生物對PAHs的吸附,進(jìn)而影響整個降解過程[6].那么,在這個過程中,微生物是如何調(diào)節(jié)自身的生理生化過程來適應(yīng)外界環(huán)境的變化,以實(shí)現(xiàn)對PAHs的運(yùn)輸和代謝,是近年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn).

蛋白質(zhì)組學(xué)通過研究蛋白質(zhì)及其組分,從而用來分析不同環(huán)境下微生物蛋白質(zhì)表達(dá)的差異.近年來,國內(nèi)外學(xué)者利用蛋白質(zhì)組學(xué)的優(yōu)勢來探究微生物降解石油烴過程的微觀機(jī)理[7].例如利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了銅綠假單胞菌SJTD-1的383種烷烴反應(yīng)蛋白,并且將這些蛋白質(zhì)與微生物的多種生化途徑聯(lián)系在了一起[8].此外,利用同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)(iTRAQ技術(shù))比較熒蒽誘導(dǎo)不同時間下紅球菌BAP-1全蛋白表達(dá)的差異,發(fā)現(xiàn)絕大部分差異蛋白參與代謝和能量產(chǎn)生過程[9].本文在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,對熒蒽誘導(dǎo)不同時間下紅球菌BAP-1細(xì)胞膜蛋白的差異進(jìn)行研究,旨在結(jié)合我們的前期研究成果,從蛋白質(zhì)層面上明確紅球菌BAP-1跨膜運(yùn)輸熒蒽過程中起關(guān)鍵作用的膜蛋白種類及其作用機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 菌種培養(yǎng)

紅球菌BAP-1(GenBank entry:JX683682, CGMCC ID:7.68)是課題組從天津?yàn)I海濕地石油污染場地分離篩選所得,能夠有效降解熒蒽等多種PAHs.BAP-1在LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)36h后,轉(zhuǎn)入熒蒽濃度為3mg/L的無機(jī)鹽(MSM)培養(yǎng)基,在30℃, 110rpm條件下進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn).

1.2 試劑和儀器

1.2.1 培養(yǎng)基 本研究采用了2種培養(yǎng)基,LB培養(yǎng)基和MSM培養(yǎng)基的配方參考許潔等[10]的文章.熒蒽誘導(dǎo)MSM培養(yǎng)基:在已滅菌的MSM中加入一定量的熒蒽丙酮溶液,使熒蒽濃度達(dá)到3mg/L,在無菌操作臺靜置6h使丙酮完全揮發(fā).

1.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器 LC-20AB液相色譜(島津), LC-20AD納升液相色譜儀(島津),ESI串聯(lián)質(zhì)譜儀:TripleTOF5600(SCIEX,Framingham,MA,USA),離子源為Nanospray III source (SCIEX, Framingham, MA, USA),放射器為石英材料拉制的噴針(New Objectives, Woburn, MA, USA).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)置 利用3mg/L熒蒽分別誘導(dǎo)降解菌0,1,3和6d,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個平行樣,3個比對組分別為1d/0d,3d/1d和6d/3d,以確定不同時間段內(nèi)BAP-1膜蛋白變化情況.

1.3.2 紅球菌膜蛋白提取 采用貝博細(xì)菌膜蛋白提取試劑盒提取BAP-1的膜蛋白.按照試劑盒提供的步驟,對熒蒽誘導(dǎo)0,1,3和6d下的BAP-1膜蛋白進(jìn)行提取,并對所提膜蛋白進(jìn)行質(zhì)控.

1.3.3 蛋白酶解和肽段標(biāo)記 每個樣品取100ug蛋白溶液,在37℃下,用測序級胰蛋白酶(蛋白和酶的比例為40:1)酶解膜蛋白4h,然后按上述比例再補(bǔ)加胰蛋白酶一次,37℃繼續(xù)酶解8h.酶解后的肽段溶于30μL 0.5mol/L三乙胺-碳酸緩沖液(TEAB)中.每組的肽段分別用iTRAQ Reagent 8-plex One Assay Kit (AB Sciex,Framingham,MA)進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記.

1.3.4 肽段分離 肽段在島津LC-20AB高效液相色譜-高pH-RP柱系統(tǒng)中進(jìn)行分離.用2mL緩沖液A (5%ACN pH=9.8)重組肽段,然后以1mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫分離:0~10min,5%緩沖液B(95%ACN pH=9.8); 10~50min,5%~35%緩沖液B; 50~51min, 35%~95%緩沖液B,并在95%緩沖液B條件下保持3min;最后5%緩沖液B平衡10min.通過測量在214nm處的吸光度來監(jiān)測洗脫,并且每分鐘收集組分,洗脫的肽段匯集為20個組分并真空干燥.

1.3.5 高效液相 肽段樣品用緩沖液A(2%ACN, 0.1%FA)重懸復(fù)溶,20,000g離心10min后,取上清進(jìn)樣.通過LC-20AD納升液相色譜儀進(jìn)行分離.樣品首先進(jìn)入trap柱富集并除鹽,隨后與自裝C18柱串聯(lián),以300nL/min流速通過如下有效梯度進(jìn)行分離: 0~8min,5%緩沖液B (98%ACN,0.1% FA); 8~43min,緩沖液B從8%線性升至35%; 43~48min,緩沖液B從35%升至60%; 48~50min,緩沖液B從60%升至80%; 50~55min,80%緩沖液B; 55~65min,5%緩沖液B.納升液相分離末端直接連接質(zhì)譜儀.

1.3.6 質(zhì)譜檢測 在參數(shù)為離子噴霧電壓2300V,氮?dú)鈮毫?0psi,噴霧氣壓力15psi,界面加熱器溫度150℃的高靈敏度模式下進(jìn)行數(shù)據(jù)采集.一級質(zhì)譜掃描的累積時間為250ms,質(zhì)量范圍為350~1500Da.按照一級譜圖中的離子強(qiáng)度從高到低,選擇強(qiáng)度超過150cp的前30個進(jìn)行碎裂并掃描二級信息,篩選標(biāo)準(zhǔn)如下: m/z范圍為350~1250Da;電荷數(shù)目為2~5個電荷;母離子動態(tài)排除設(shè)置為:在一半的出峰時間內(nèi)(約12s),相同母離子的碎裂不超過2次.二級質(zhì)譜的掃描累積時間為100ms.針對iTRAQ類型的數(shù)據(jù)采集,碎裂能量選擇根據(jù)iTRAQ試劑調(diào)整,第二個四級桿Q2在100Da時的離子傳輸效率為100%.

1.3.7 蛋白質(zhì)分析 得到原始數(shù)據(jù)后,進(jìn)行統(tǒng)一的信息分析.圖1顯示了完整的iTRAQ定量流程.數(shù)據(jù)合格后經(jīng)過一定的篩選閾值,得到最終可信的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果.隨后進(jìn)行iTRAQ定量分析,從定量結(jié)果中篩選出我們更為關(guān)心的顯著差異蛋白.在有重復(fù)實(shí)驗(yàn)的情況下,定量重復(fù)性分析判斷本次定量數(shù)據(jù)質(zhì)量是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn).最后進(jìn)行差異蛋白的COG和GO富集分析.

在譜圖/肽段水平進(jìn)行1% FDR的過濾(PSM-level FDR￡0.01),從而獲得顯著性鑒定的譜圖和肽段列表.利用肽段進(jìn)行蛋白組裝,并產(chǎn)生一系列的蛋白組.在Q-value<0.05的情況下,利用兩組iTRAQ定量的比值>1.5或<0.67認(rèn)為有差異,取2組平均值為最終差異倍數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 差異蛋白聚類分析

分別以熒蒽誘導(dǎo)0,1和3d的紅球菌BAP-1的膜蛋白為各個時段的對照,設(shè)置3個比對組分別為1d/0d,3d/1d和6d/3d.以Q-value￡0.05和Fold change>1.5(即上調(diào)>1.5,下調(diào)<0.67)為差異膜蛋白的篩選條件,共鑒定到172個蛋白.

表1 3個比對組鑒定到的差異膜蛋白數(shù)

圖2 3個比對組鑒定到的差異膜蛋白維恩圖

由表1可知,與各自對照組做比對時,隨誘導(dǎo)時間的延長,鑒定到的差異膜蛋白總數(shù)呈現(xiàn)略微下降的趨勢,具體來看,下調(diào)膜蛋白在各個時間段的數(shù)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,上調(diào)膜蛋白的數(shù)量則逐步上升.反應(yīng)初期,菌體從LB培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到熒蒽MSM培養(yǎng)液中,面臨著營養(yǎng)物質(zhì)變少的壓力,通過大量下調(diào)一些與熒蒽轉(zhuǎn)運(yùn)無關(guān)的膜蛋白,來減少能量的耗散,以維持細(xì)胞正常的生命活動.隨著反應(yīng)時間的增加,微生物逐漸適應(yīng)熒蒽脅迫的環(huán)境,需要調(diào)節(jié)下降的膜蛋白數(shù)量逐漸降低,在3~6d時間段內(nèi)下調(diào)的膜蛋白幾乎沒有;而上調(diào)膜蛋白的數(shù)量逐漸上升,在3~6d有72個膜蛋白上調(diào).微生物需要通過攝取環(huán)境中的熒蒽來維持正常的生命活動,因此需要上調(diào)與熒蒽轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的跨膜蛋白.相較于對膜蛋白的抑制作用,熒蒽對于BAP-1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的促進(jìn)表達(dá)作用存在一個相對滯后的過程.

圖3 83個差異膜蛋白的熱圖

從圖2中可以看出,3個對比組中共有的膜蛋白不是很多,僅有3個,但是兩兩組別共有的膜蛋白分別有28,37和15個,根據(jù)這83個差異膜蛋白在各自對比組中的差異倍數(shù)(沒有差異的令差異倍數(shù)為1),得到這83個蛋白的熱圖(圖3).

從圖3中可以看出,大部分膜蛋白先是先下調(diào)(熱圖中顯黃色),然后上調(diào)(紅色)或者保持不變(淺紅色),這與我們之前發(fā)現(xiàn)的上調(diào)膜蛋白滯后的規(guī)律相似.根據(jù)圖2,發(fā)現(xiàn)在組別1d/0d中,顯著上調(diào)的膜蛋白為TonB受體蛋白、異檸檬酸脫氫酶、磷酸甘油酸激酶、丙酮酸脫氫酶等,下調(diào)的膜蛋白主要為膜脂蛋白、鞭毛蛋白、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)酶等;在3d/1d中,顯著上調(diào)的蛋白主要為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、ATP合成酶、核苷二磷酸激酶等,下調(diào)的膜蛋白主要為丙酮酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、乙醛脫氫酶和延伸因子等;而在6d/3d中,顯著上調(diào)的膜蛋白主要為超氧化物歧化酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、乙醇胺利用蛋白等,下調(diào)的膜蛋白主要為2個TonB依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和2個ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.

不難發(fā)現(xiàn),隨著時間的變化,一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量逐漸升高,說明紅球菌BAP-1適應(yīng)脅迫環(huán)境之后,能夠通過膜蛋白的變化來提高對熒蒽的跨膜運(yùn)輸過程.

2.2 差異蛋白COG功能分類

對差異膜蛋白進(jìn)行正交同源蛋白組(COG)的功能分類.COG是一個用于分類同源蛋白的數(shù)據(jù)庫,同源物通常具有相同的功能.

圖4 3個比對組中差異膜蛋白的COG功能分類

從圖4可以發(fā)現(xiàn),熒蒽的加入主要影響了紅球菌BAP-1細(xì)胞膜上的與能量、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的膜蛋白.同時,熒蒽的加入還影響了其他功能的膜蛋白,包括無機(jī)離子運(yùn)輸與代謝,蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn),細(xì)胞壁/膜/包膜生物合成,細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和水泡運(yùn)輸?shù)?這說明紅球菌BAP-1跨膜運(yùn)輸熒蒽的過程是復(fù)雜的,是需要多種膜蛋白共同參與的一個過程.另外,在3個組別中,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝,能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化以及碳水化合物運(yùn)輸和代謝均占了大多數(shù)的比例.表明紅球菌BAP-1對熒蒽的吸附攝取和跨膜運(yùn)輸是一個能量消耗過程.這也再次證明了作者之前研究結(jié)論:紅球菌BAP-1對熒蒽的跨膜運(yùn)輸過程是需要能量的主動運(yùn)輸過程,是紅球菌BAP-1降解熒蒽的重要步驟[10].

2.3 差異蛋白的GO富集分析

GO(Gene ontology)數(shù)據(jù)庫分別從參與的生物途徑,細(xì)胞功能及在細(xì)胞中的定位對蛋白進(jìn)行了注釋,對差異膜蛋白進(jìn)行GO富集分析可以大致了解差異膜蛋白參與了哪些生物過程,擁有哪些分子功能以及構(gòu)成哪些細(xì)胞組件.

表2 3個比對組中差異膜蛋白的GO富集

從表2可以看出,差異膜蛋白主要參與的生物過程是轉(zhuǎn)運(yùn)及氧化還原過程,一小部分的蛋白參與了電子傳遞鏈、無性孢子形成、肌醇分解代謝以及半胱氨酸生物合成過程.從分子功能上看,3個組別中的差異蛋白也主要集中在轉(zhuǎn)運(yùn)活動以及結(jié)合三磷酸腺苷、結(jié)合金屬離子等活動上,少數(shù)膜蛋白參加了水解活動.氧化還原過程、電子傳遞鏈能夠?yàn)槲⑸锟缒み\(yùn)輸提供能量,因此他們的變化影響著轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變化.

由于所提取的是紅球菌BAP-1的膜蛋白,從細(xì)胞組件來看,不難發(fā)現(xiàn),多數(shù)蛋白作為細(xì)胞膜的組成成分,少部分構(gòu)成細(xì)胞質(zhì)的蛋白可能是一些吸附在內(nèi)膜上的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.

3 討論

3.1 組別1d/0d中的差異膜蛋白

在組別1d/0d中,共有11個差異膜蛋白上調(diào)以及87個膜蛋白顯示下調(diào).上調(diào)的膜蛋白包括丙酮酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、醇脫氫酶以及延伸因子等,下調(diào)的膜蛋白包括膜脂蛋白、鞭毛蛋白、孢子外殼蛋白等.

丙酮酸脫氫酶能夠通過丙酮酸脫羧過程把丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A,而乙酰輔酶A被利用于檸檬酸循環(huán),因此丙酮酸脫氫酶能夠連接糖酵解代謝與檸檬酸循環(huán),并通過NADH釋放能量. Subashchandrabose等人[11]的研究發(fā)現(xiàn),芘生長環(huán)境會導(dǎo)致丙酮酸脫氫酶復(fù)合體的明顯積累,證明了丙酮酸脫氫酶在PAHs降解中起到了一定的作用.相比于0d,丙酮酸脫氫酶在反應(yīng)進(jìn)行1d后的表達(dá)上調(diào)了3.26倍.熒蒽進(jìn)入紅球菌BAP-1細(xì)胞內(nèi)是微生物的主動運(yùn)輸過程,需要消耗大量的能量.丙酮酸脫氫酶的產(chǎn)生能夠幫助紅球菌BAP-1在細(xì)胞膜上產(chǎn)生大量的能量,從而使其能更好的對熒蒽進(jìn)行跨膜運(yùn)輸.

異檸檬酸脫氫酶(IDH)是一種催化異檸檬酸氧化脫羧,并能產(chǎn)生α-酮戊二酸和CO2的酶.IDH參與三羧酸循環(huán),還原氧化NAD+為NADH,被認(rèn)為是三羧酸循環(huán)中的限速酶.因此,IDH活性對生物體的代謝有巨大影響[12].氧化木糖無色桿菌DN002降解熒蒽的過程中,Ma等人鑒定到了異檸檬酸等許多差異蛋白,基于這些鑒定的蛋白質(zhì),推斷細(xì)菌菌株DN002遵循在C-2,3位的熒蒽雙氧化的主要過程,并通過鄰苯二甲酸和鄰苯二酚作為中間體介導(dǎo)[13].IDH的表達(dá)量在第1d上調(diào)了3.03倍,說明在紅球菌BAP-1細(xì)胞膜上不僅有跨膜蛋白,還能夠?qū)奢斓囊恍┐x產(chǎn)物進(jìn)行繼續(xù)代謝,用于產(chǎn)生能量,從而繼續(xù)進(jìn)行對熒蒽的跨膜運(yùn)輸.

醇脫氫酶(ADH)是在許多生物體中發(fā)生的一組脫氫酶,促進(jìn)醇和醛或酮之間的相互轉(zhuǎn)化.Kong等[14]研究了假單胞菌JP1在低氧條件下菲的降解機(jī)理.RNA測序和RT-qPCR結(jié)果表明,在PAHs暴露過程中,醇脫氫酶基因表達(dá)上調(diào)了 3.16倍.此外,采用雙向電泳(2-DE)和MALDI-FT-ToF技術(shù)研究了與菲降解有關(guān)的蛋白質(zhì),發(fā)現(xiàn)醇脫氫酶參與了菲的分解代謝過程.在我們的研究中,醇脫氫酶在第1d上調(diào)了1.79倍,說明了醇脫氫酶在紅球菌BAP-1跨膜運(yùn)輸熒蒽的過程中發(fā)揮了重要作用.表明紅球菌BAP-1細(xì)胞膜的作用不僅僅在于保護(hù)細(xì)胞、周轉(zhuǎn)物質(zhì),還能分泌許多酶以促進(jìn)對熒蒽的運(yùn)輸和降解.

鞭毛蛋白是細(xì)菌鞭毛的主要成分,是細(xì)菌在液體中運(yùn)動的主要工具.紅球菌BAP-1從LB培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到含有熒蒽的MSM培養(yǎng)液后,營養(yǎng)物質(zhì)變少,微生物通過減少自身運(yùn)動降低能量消耗,使更多的能量用于跨膜運(yùn)輸上,因此鞭毛蛋白的表達(dá)量在第1d下調(diào)了0.36倍.膜脂蛋白和孢子外殼蛋白在第1d也分別下調(diào)了0.14和0.44倍,這兩類蛋白的減少,一方面說明紅球菌BAP-1在營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的情況下減少不必要蛋白的合成來減少能量的耗散,另一方面又能夠增加細(xì)胞膜的通透性,使熒蒽的跨膜運(yùn)輸過程更加便捷.

3.2 組別3d/1d中的差異膜蛋白

在組別3d/1d中,共有28個差異膜蛋白上調(diào)以及56個膜蛋白顯示下調(diào).上調(diào)的膜蛋白包括TonB-依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、ATP合成酶、細(xì)胞色素C等,并且在組別1d/0d中下調(diào)的鞭毛蛋白、孢子外殼蛋白在3d/1d中也顯示出了上調(diào).下調(diào)的膜蛋白包括乙醛脫氫酶、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等.

TonB-依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TBDT)允許細(xì)菌從營養(yǎng)限制環(huán)境攝取包括鐵載體、血紅素、維生素B12和碳水化合物等資源[15].sp.通過細(xì)胞膜上的TBDTs來跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)殼寡糖,這為它們在營養(yǎng)不良的環(huán)境里提供生存優(yōu)勢[16].相較于第1d,共有2種TonB-依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量得到了上調(diào),分別為4.14和2.35倍,說明它們很有可能作為載體參與了紅球菌BAP-1對熒蒽的跨膜運(yùn)輸過程,為紅球菌BAP-1在營養(yǎng)匱乏的環(huán)境中提供了生存優(yōu)勢.

ATP合成酶在細(xì)胞內(nèi)催化能源物質(zhì)ATP的合成,通過電子傳遞鏈釋放的能量先轉(zhuǎn)換為跨膜質(zhì)子(H+)梯度差,之后質(zhì)子流順質(zhì)子梯度差通過ATP合成酶使ADP+Pi合成ATP.ATP水解時釋放出能量較多,是生物體內(nèi)最直接的能量來源.以往的研究表明,紅球菌BAP-1在跨膜運(yùn)輸熒蒽的過程需要能量[10]. ATP合成酶在反應(yīng)進(jìn)行3d后比第1d上調(diào)了5.91倍,證明在這個階段內(nèi),大量的能量產(chǎn)生,可能是由于紅球菌BAP-1在這個階段開始大量降解熒蒽及其代謝產(chǎn)物,或者是由于紅球菌BAP-1在逐漸適應(yīng)熒蒽環(huán)境后,開始大量進(jìn)行熒蒽的跨膜運(yùn)輸,從而需要大量能量的支持.

磷酸甘油酸激酶是糖酵解過程中的主要酶,是糖酵解途徑的第一個ATP生成步驟.同樣的,乙醛脫氫酶以及蘋果酸脫氫酶等都是微生物用來產(chǎn)能的蛋白.他們在反應(yīng)進(jìn)行3d后,都有不同程度的下調(diào),說明紅球菌BAP-1能夠調(diào)整自己產(chǎn)能的方式,在不同階段選取最適合自己的產(chǎn)能方式來讓自己更好的適應(yīng)環(huán)境.

3.3 組別6d/3d中的差異膜蛋白

在組別6d/3d中,共有72個差異膜蛋白上調(diào)以及4個膜蛋白顯示下調(diào).上調(diào)的蛋白包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、超氧化物歧化酶、過氧化氫催化酶等.下調(diào)的蛋白為2個ABC轉(zhuǎn)運(yùn)酶和2個TonB-依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白.

ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通常由多個亞基組成,其中一兩個是跨膜蛋白,另一些是跨膜相關(guān)的ATP酶.ATP酶亞單位利用三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合和水解的能量來激發(fā)各種底物在膜上的遷移,用于吸收或?qū)С龅孜?研究表明,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在多種生物過程中起作用,包括在細(xì)胞膜中起轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用,并且能夠?qū)Νh(huán)境中的PAHs做出一定的響應(yīng)[17].相較于反應(yīng)進(jìn)行的第3d,熒蒽誘導(dǎo)下反應(yīng)6d的紅球菌BAP-1有9種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上調(diào),但也有2種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白顯示下調(diào),說明隨著不斷的誘導(dǎo)和適應(yīng),在6d,紅球菌BAP-1在各種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的協(xié)作之下,對熒蒽的跨膜運(yùn)輸進(jìn)行得更為順利.

超氧化物歧化酶是一種催化超氧化物自由基分解成普通分子氧或過氧化氫的酶.超氧化物是氧代謝的副產(chǎn)物,如果不加以調(diào)節(jié),會導(dǎo)致多種類型的細(xì)胞損傷.過氧化氫酶催化過氧化氫分解為水和氧.它是保護(hù)細(xì)胞免受活性氧(ROS)氧化損傷的非常重要的酶.研究表明,萘和芘能夠改變銅綠假單胞菌PCC7806的生長,降低其藻藍(lán)蛋白的含量,并且刺激超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的活性[18].在反應(yīng)開始進(jìn)行的第6d,超氧化物歧化酶和過氧化氫酶分別上調(diào)了5.58和2.7倍,說明紅球菌BAP-1在含有熒蒽的環(huán)境中生長,需要通過改變抗氧化防御系統(tǒng)來維持自身的生理生化過程.

前期實(shí)驗(yàn)對紅球菌BAP-1在第1,3,6d的熒蒽降解率進(jìn)行了測定,發(fā)現(xiàn)在第6d熒蒽的降解速率最高.在第6d,超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的過量表達(dá),維持了微生物的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定.與此同時,相較于反應(yīng)前期,更多的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)使得微生物能更多的轉(zhuǎn)運(yùn)體系中的熒蒽,使得降解效率提高.

4 結(jié)論

4.1 共鑒定到172個差異膜蛋白,隨誘導(dǎo)時間的延長,鑒定到的差異膜蛋白總數(shù)呈現(xiàn)略微下降的趨勢.對差異膜蛋白進(jìn)行聚類分析,表明下調(diào)膜蛋白在各個時間段的數(shù)量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,上調(diào)膜蛋白的數(shù)量則逐步上升;大部分膜蛋白先是先下調(diào),然后上調(diào)或者保持不變.說明紅球菌BAP-1適應(yīng)脅迫環(huán)境之后,能夠通過膜蛋白的變化來提高對熒蒽的跨膜運(yùn)輸過程.

4.2 通過差異膜蛋白的COG和GO功能分析,發(fā)現(xiàn)熒蒽的加入主要影響了紅球菌BAP-1細(xì)胞膜上的與能量、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的膜蛋白;在三個組別中,氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化以及碳水化合物運(yùn)輸和代謝共占據(jù)了近一半的比例.表明紅球菌BAP-1對熒蒽的吸附攝取和跨膜運(yùn)輸是一個能量消耗過程.

4.3 通過對不同Cluster組別進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和Ton-B依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為膜蛋白中最主要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,隨著時間的推移,表達(dá)量逐漸上調(diào),顯示了它們在紅球菌BAP-1跨膜運(yùn)輸熒蒽過程中的重要性. 超氧化物歧化酶和過氧化氫酶在6d的表達(dá)量分別達(dá)到了5.58和2.7倍,從而起到保護(hù)微生物的作用.在反應(yīng)進(jìn)行的不同階段,紅球菌BAP-1能夠調(diào)整自己產(chǎn)能的方式,選取最適合自己的產(chǎn)能方式來讓自己更好的適應(yīng)環(huán)境.

4.4 各種膜蛋白在反應(yīng)進(jìn)行的不同階段發(fā)揮著各自作用,為紅球菌BAP-1跨膜運(yùn)輸熒蒽提供著必要的能量,這些膜蛋白共同組成蛋白互作網(wǎng)絡(luò)調(diào)控紅球菌BAP-1的跨膜運(yùn)輸過程.

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Differential membrane protein analysis ofduring the transmembrane-transport process of fluoranthene.

KONG De-kang1, LI Yi2*, WANG Hong-qi1*, XU Jie1, GUAN Jing-jing1

(1.College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China；2.College of Environment and Resource, Guangxi Normal University, Guilin 541004, China)., 2019,39(1)：274~280

Comparative proteomics analysis was performed on membrane proteins extracted fromBAP-1on consecutive fluoranthene exposure days by using isobaric tags for relative and absolute quantization (iTRAQ) labelling and LC-MS/MS analysis to access differentially expressed membrane proteins. A total of 172differential membrane proteins were identified. The enrichment of COG and GO terms analysis of differentially expressed membrane proteins in three clusters showed that most of the differential proteins were involved in transport and oxidation-reduction processes. ABC transporters and TonB-dependent receptors played an important role in transmembrane-transport of fluoranthene. Catalase and superoxide dismutase had a significant up-regulation in sixth days as an antioxidant defence mechanism to protect microbes. Various energy-produced proteins played their respective roles at different stages, and constituted a protein interaction network to regulate transmembrane-transport of microorganisms.

sp. BAP-1；fluoranthene；membrane protein；transmembrane-transport；iTRAQ

X172

A

1000-6923(2019)01-0274-07

孔德康(1993-),男,浙江湖州人,碩士研究生,主要從事污染土壤修復(fù)與治理研究.發(fā)表論文5篇.

2018-05-16

國家自然科學(xué)基金資助面上項(xiàng)目(41372232);廣西高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研究基金資助項(xiàng)目(YRHJ152024);廣西自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(2017GXNSFBA198168)

* 責(zé)任作者, 王紅旗, 教授, amba@bnu.edu.cn; * 李藝, 講師, liyi412@mailbox.gxnu.edu.cn