中蔗系列甘蔗品種的黑穗病抗性鑒定

張姍姍 ，張沛然 ，蘭仙軟 ，李茹 ，2，黃有總 ，陳保善 ，2

（1.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南寧 530004；2.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實驗室，南寧 530004；3.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004）

0 引言

甘蔗是一種多年生的宿根性熱帶植物，是中國主要的糖料作物，甘蔗糖產(chǎn)量占全國食糖總產(chǎn)量的90%以上[1]。甘蔗黑穗病是一種世界性的甘蔗真菌病害，感染黑穗病的甘蔗植株葉細(xì)長，莖細(xì)小，一株染病所有分蘗都可能發(fā)病，嚴(yán)重影響甘蔗產(chǎn)量及品質(zhì)[2-5]。目前，抗病育種是防治甘蔗黑穗病最經(jīng)濟(jì)有效的措施，世界各甘蔗種植國家都把黑穗病抗性作為選育新品種的指標(biāo)之一[6]。

我國蔗區(qū)主要分布在廣西、廣東、云南、海南和福建，尤以廣西種植面積最大。ROC22是廣西蔗區(qū)長達(dá)20余年的主栽品種，種植面積達(dá)60%以上。ROC22對黑穗病敏感，其抗性等級被評定為高感[7-8]。由于甘蔗品種長期單一化，甘蔗黑穗病在廣西蔗區(qū)越發(fā)嚴(yán)重[9]。因此，選育甘蔗抗黑穗病的新品種對廣西甘蔗可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。中蔗系列新品種中蔗1號、中蔗6號和中蔗9號田間綜合表現(xiàn)優(yōu)良，選育過程及多年多地試種表明，中蔗系列新品種田間表現(xiàn)出很高的黑穗病抗性。為全面評價這些品種的黑穗病抗性，本研究利用人工接種結(jié)合病區(qū)大田自然發(fā)病的方法，對其進(jìn)行系統(tǒng)評價，以期為新品種審定、推廣提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試品種

供試甘蔗品種：中蔗1號、中蔗6號、中蔗9號和ROC22。

中蔗系列品種（系）是由廣西大學(xué)團(tuán)隊從ROC25×云蔗89-7組合選育的甘蔗新品種（系）。該系列甘蔗新品種與目前廣西壯族自治區(qū)常規(guī)甘蔗種植品種相比較，具有大莖，有效莖多，特高產(chǎn)，高糖，宿根性好，高抗黑穗病，抗倒伏，極易脫葉，耐旱耐寒等優(yōu)點(diǎn)[10]。ROC22為目前廣西主栽品種，田間表現(xiàn)為高感黑穗病。

1.2 黑穗菌菌株的培養(yǎng)獲得與接種

1.2.1 黑穗菌菌株的培養(yǎng)獲得

2017年5月從廣西河池、柳州、崇左3個蔗區(qū)采集黑穗病黑鞭，取少量冬孢子粉，用無菌水適度稀釋后涂布至含有抗生素Amp+Kan+Cef+Sep的YEPS固體培養(yǎng)基，于28℃培養(yǎng)2～3 d，挑取單菌，獲得單倍體擔(dān)孢子分離株。將不同來源的擔(dān)孢子分離株進(jìn)行兩兩配對，于YEPS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行交叉培養(yǎng)（28℃，2～3 d），觀察菌落生長情況。菌落若為白色羊毛狀的，表明兩單倍體為異型（+、-）交配型；菌落若為酵母狀的，兩單倍體為同型交配型。分別在每個來源地挑取一對配合最佳的異型交配型單倍體，保存于-80℃冰箱備用。JG35、JG36為實驗室保存的從廣西南寧市蔗區(qū)分離到的一對異型單倍體菌株。

1.2.2 接種方法

將保存于-80℃冰箱的異性交配型單倍體菌株在YEPS固體培養(yǎng)基劃線活化，28℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2～3 d。挑取單菌落轉(zhuǎn)接于YEPS液體培養(yǎng)基中，28℃搖床過夜培養(yǎng)。取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至20 mL新鮮的YEPS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至孢子濃度為1×107個/mL。4 000 r/min離心5 min收集菌體，沉淀用無菌水洗兩次后，加入20 mL無菌水懸浮。將異型單倍體兩兩對應(yīng)混合并充分搖勻，用于注射接種。

取半年蔗供試甘蔗莖，健康單芽種植于盆栽桶中（每桶種植5個芽）。每個處理設(shè)置5桶，共25個芽。當(dāng)小苗生長至第5張葉片充分展開時，用無菌注射器將100 μL單倍體混合懸浮液（1×106個孢子）小心注入甘蔗生長點(diǎn)。以100 μL無菌水接種作為對照。

1.3 調(diào)查方法

1.3.1 人工接種調(diào)查

定期調(diào)查發(fā)病株數(shù)，統(tǒng)計不同品種發(fā)病潛伏期，計算每處理最終發(fā)病率。連續(xù)觀察至發(fā)病終止。發(fā)病率=（累計發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)）×100%?？剐缘燃墑澐植捎棉r(nóng)業(yè)部“九五”攻關(guān)項目病害的統(tǒng)一分級標(biāo)準(zhǔn)[11]（表1）。

表1 甘蔗黑穗病抗性等級評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation criteria for sugarcane smut resistance

1.3.2 大田定點(diǎn)系統(tǒng)調(diào)查

按照全國甘蔗品種試驗實施方案，對4個品種采用完全隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，行距1．2 m，于2017年3月種植于廣西崇左市扶綏縣甘蔗試驗地。試驗地肥力中等，已種植甘蔗多年，為黑穗病重病區(qū)。一年宿根甘蔗黑穗發(fā)病率調(diào)查于2018年6月和10月進(jìn)行。發(fā)病率以“叢”為單位計算，每個品種調(diào)查250叢。

1.3.3 生產(chǎn)示范點(diǎn)抽樣調(diào)查

本實驗室在廣西龍州、武鳴、扶綏等縣（區(qū)）有甘蔗生產(chǎn)示范點(diǎn)，由當(dāng)?shù)卣徂r(nóng)管理。龍州蔗區(qū)新植中蔗1號2．67 hm2，于2017年2月種植。武鳴華僑農(nóng)場團(tuán)結(jié)分場新植中蔗9號31．33 hm2，于2017年6—8月種植，2018年3月留宿根。廣西大學(xué)扶綏農(nóng)科基地有宿根2年中蔗1號0．27 hm2，中蔗9號0．13 hm2；新植中蔗1號13．33 hm2，于2018年8月初種植；新植中蔗6號20 hm2，于2018年8月初種植；新植中蔗 9號100 hm2，于2018年3—6月種植。以示范點(diǎn)周邊農(nóng)戶大量種植的感黑穗病品種ROC22、桂糖42或柳城05-136為對照。對示范點(diǎn)及對照地塊進(jìn)行抽樣調(diào)查，統(tǒng)計黑穗病發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工接種鑒定結(jié)果

經(jīng)單倍體分離與配合試驗，本研究新挑選出3對交配型單倍體菌株，按分離地點(diǎn)和交配型屬性分別命名為河1和河2、柳3和柳4及崇3和崇4，其中單數(shù)和雙數(shù)分別屬于不同的交配型。加上之前所分離的JG35和JG36菌株，共有4對菌株被用于接種試驗。

人工接種發(fā)病率結(jié)果與抗性等級鑒定結(jié)果見表2。與廣西主栽品種ROC22相比，3個中蔗系列品種對所有供試菌株組合的發(fā)病率更低且發(fā)病潛伏期更長，4個供試材料對黑穗病抗性強(qiáng)度依次為：中蔗9號＞中蔗1號＞中蔗6號＞ROC22（依據(jù)各品種4對接種菌株抗性等級平均值）。對同一品種而言，病原菌組合崇3+崇4導(dǎo)致的發(fā)病率最高，河1+河2組合導(dǎo)致的發(fā)病率最低，表明廣西甘蔗黑穗病菌有致病性分化。無菌水注射均無發(fā)病。

表2 4個甘蔗品種人工接種黑穗病抗性鑒定結(jié)果Table 2 Smut resistance of 4 sugarcane varieties inoculated

2.2 大田宿根蔗抗病性表現(xiàn)

定點(diǎn)調(diào)查結(jié)果表明，撥節(jié)期（6月份）中蔗1號、中蔗6號的黑穗病發(fā)病率為0%，中蔗9號發(fā)病率為0.4%，ROC22的發(fā)病率為6.4%；工藝成熟前期（10月份）各品種的累計黑穗病發(fā)病率分別為0%、0%、0.4%和6.8%。此外，對中蔗1號和中蔗9號第二年宿根蔗進(jìn)行全面調(diào)查，二者黑穗病發(fā)生率均為0%。

2.3 示范田及生產(chǎn)大田調(diào)查

2017年2月在廣西龍州新植中蔗1號2.67 hm2，至2018年1月抽樣調(diào)查，黑穗病發(fā)生率為0.2%；2017年6—8月在廣西武鳴華僑農(nóng)場團(tuán)結(jié)分場新植中蔗9號31.33 hm2，系統(tǒng)觀察至2018年3月，黑穗病發(fā)生率為0.1%；相同地塊留宿根，系統(tǒng)觀察至2018年10月，黑穗病發(fā)生率為0.05%。2018年3—6月在廣西大學(xué)扶綏農(nóng)科基地新植中蔗9號100 hm2，系統(tǒng)觀察至2018年10月，黑穗病發(fā)生率為0%。同期在廣西龍州的生產(chǎn)大田新植ROC22黑穗病發(fā)生率為4%～6%，宿根為12%～15%；桂糖42新植為6%～8%，宿根一年為14%～16%。廣西武鳴新植ROC22黑穗病發(fā)生率為5%～6%，宿根一年為13%～14%；柳城05-136新植為3%～4%，宿根一年為10%～12%。廣西扶綏新植ROC22黑穗病發(fā)生率為4%～5%，宿根一年為12%～14%；桂糖42新植為5%～6%，宿根兩年為18%～22%。

3 討論

甘蔗黑穗病是廣西甘蔗病害中影響最嚴(yán)重的真菌性病害，該病害的發(fā)生是通過冬孢子傳播實現(xiàn)的。黑鞭上成熟的冬孢子借氣流、雨水、灌溉水和昆蟲等方式進(jìn)行傳播，在適宜的溫濕度條件下萌發(fā)[12]，侵染蔗芽。甘蔗黑穗病抗性鑒定的傳統(tǒng)方法為浸漬接種法和針刺接種法[13]。但傳統(tǒng)方法需要前期收集大量冬孢子，工作量大。本實驗通過對少量冬孢子進(jìn)行單倍體分離與配合，以異型交配型單倍體混合接種，發(fā)病潛伏期短，發(fā)病率高，可以充分鑒定出不同品種的抗性特性[14]。人工注射結(jié)果表明中蔗1號、中蔗6號、中蔗9號相對于ROC22對黑穗病表現(xiàn)出更高的抗性，這與田間調(diào)查的品種抗性趨勢一致。值得一提的是，我們在大田中共調(diào)查了18個甘蔗品種或中間材料，除了從美國引進(jìn)的材料GUC3和GUC8發(fā)病率為零外，其他13個甘蔗品種（1702、TD7、TD11等）黑穗病發(fā)病率都明顯高于中蔗系列品種。感病品種宿根蔗比新植蔗發(fā)病嚴(yán)重，宿根年限越長，發(fā)病越為嚴(yán)重。而中蔗1號、中蔗6號、中蔗9號在田間表現(xiàn)出良好的抗性，且宿根蔗的黑穗病發(fā)生率沒有增加的跡象。

甘蔗黑穗病菌主要通過蔗芽侵染甘蔗，雙核菌絲體穿過芽鱗，盤踞于分生組織區(qū)，刺激組織病變，直至病鞭抽出[15]。甘蔗對黑穗病的抗性機(jī)制主要有形態(tài)學(xué)抗性和生理生化抗性兩種機(jī)制。本研究中，人工注射接種發(fā)病率明顯高于自然發(fā)病率，與前人研究結(jié)果一致[14，16]。人工注射接種直接跨越了蔗芽本身具有的形態(tài)學(xué)抗性機(jī)制，對甘蔗造成了創(chuàng)傷，并且直接把病菌帶入了甘蔗植株體內(nèi)，因此發(fā)病率較高。近20年來，ROC22一直是廣西蔗區(qū)的主栽品種，隨著時間的推移，ROC22黑穗病的發(fā)病情況也越來越嚴(yán)重。高抗黑穗病中蔗系列品種的應(yīng)用推廣，有望可以控制甘蔗黑穗病的蔓延。