甘蔗HD-Zip I亞家族轉(zhuǎn)錄因子基因ScGT1的克隆和生物信息學(xué)分析

李旭娟，李純佳，林秀琴，劉洪博，徐超華，字秋艷，毛鈞，陸鑫，劉新龍

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南開(kāi)遠(yuǎn)661699）

0 引言

HD-Zip I亞家族為植物特異轉(zhuǎn)錄因子，隸屬于Homeobox蛋白家族[1]，主要由高度保守的Homeodomain同源結(jié)構(gòu)域和Leu zipper元件組成，前者可與DNA特異結(jié)合，后者主要介導(dǎo)蛋白二聚體的形成[2-3]。HD-Zip I轉(zhuǎn)錄因子成員通過(guò)與其他蛋白互作，參與植物對(duì)非生物和生物逆境的應(yīng)答、激素和光信號(hào)響應(yīng)及器官發(fā)育等調(diào)控[4]。前人研究表明，植物中的一些HD-Zip I亞家族轉(zhuǎn)錄因子成員參與了植物發(fā)育等過(guò)程的調(diào)控，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）的 ATHB1[5]、ATHB13[6]、ATHB53[7]和 ATHB16[8]分別參與葉片細(xì)胞分化、蔗糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素在根發(fā)育中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和藍(lán)光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑的調(diào)控；大麥（Hordeum vulgare）的Vrs1參與六棱穗狀花序的形成，其功能缺失會(huì)導(dǎo)致二棱大麥未發(fā)育的側(cè)部小穗表現(xiàn)出發(fā)育飽滿(mǎn)多產(chǎn)的表型[9]；復(fù)蘇植物（Craterostigma plantagineum）的CpHB7參與植物器官的早期發(fā)育[10]。一些HD-Zip I亞家族轉(zhuǎn)錄因子成員可響應(yīng)逆境和植物激素脅迫，如擬南芥的ATHB6和ATHB7受干旱和外源脫落酸ABA的脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[11-12]；水稻（Oryza sativa）的Oshox22可調(diào)控ABA的合成，并通過(guò)ABA代謝途徑調(diào)控植物對(duì)干旱和鹽脅迫的響應(yīng)[13]；陸地棉（Gossypium hirsutum）的GhHB1的基因受鹽脅迫和ABA的調(diào)控[14]；向日葵（Helianthus annuus）的HAHB4響應(yīng)水分脅迫，調(diào)控抗旱相關(guān)基因的表達(dá)[15]；番茄（Lycopersicon esculentum ）的VAHOX1可被低溫誘導(dǎo)表達(dá)[16]。

分蘗是影響禾本科農(nóng)作物穗數(shù)和莖數(shù)進(jìn)而影響其株型和產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一[17]。對(duì)于無(wú)性繁殖經(jīng)濟(jì)作物——甘蔗（Saccharum spp.），靠莖稈作為收獲產(chǎn)品，而莖稈主要由分蘗莖構(gòu)成，因此分蘗可直接影響品種產(chǎn)量[18]；另外品種的宿根性也受分蘗影響，分蘗強(qiáng)的甘蔗品種往往宿根性也好[19]，基于以上認(rèn)識(shí)，解析甘蔗分蘗的生理和分子基礎(chǔ)，挖掘分蘗相關(guān)基因，對(duì)于甘蔗產(chǎn)量的改良具有重要意義。

GT1（Grassy Tiller1）是近年從玉米（Zea mays）中獲得的HD-Zip I家族轉(zhuǎn)錄因子，該基因可通過(guò)抑制玉米腋芽的萌發(fā)和側(cè)枝的伸長(zhǎng)發(fā)育來(lái)調(diào)控玉米的分蘗表現(xiàn)，其表達(dá)量受避蔭誘導(dǎo)且依賴(lài)于另一個(gè)分蘗調(diào)控基因TB1的活性，屬于TB1的下游基因[20-21]。鑒于GT1在禾本科植物分蘗調(diào)控中的重要性，本研究擬采用RTPCR和RACE技術(shù)，從甘蔗主栽品種ROC22中克隆出GT1的同源基因，并對(duì)其序列、結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)開(kāi)展生物信息學(xué)分析，以期為該基因后續(xù)更深入的功能鑒定和分子輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

使用我國(guó)主栽甘蔗品種ROC22為基因克隆材料，于甘蔗分蘗期采集蔗苗梢部生長(zhǎng)點(diǎn)組織用于RNA的提取。所有材料均由國(guó)家甘蔗種質(zhì)資源圃提供。

1.2 方法

1.2.1 模板制備

使用全式金TransZolTMPlant RNA試劑盒提取RNA。新鮮的組織樣品首先使用液氮快速研磨成粉末狀，然后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)實(shí)驗(yàn)步驟提取樣品總RNA。使用1.0%的瓊脂糖凝膠和Bio Drop Lite PC超微量可見(jiàn)紫外分光度計(jì)檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度，合格的RNA樣品使用Trans Script One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因克隆

根據(jù)前人研究報(bào)道，使用Primer Premier 5.0軟件在玉米、高粱（Sorghum bicolor）和小米（Setaria italica）GT1同源基因序列（NM001148841、XM002465650.2和XM004985270.4）的保守區(qū)設(shè)計(jì)RT-PCR引物，引物序列信息見(jiàn)表1。使用全式金Trans Taq DNA Polymerase High Fidelity（HiFi）擴(kuò)增甘蔗GT1基因片段，PCR體系按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以獲得的正確基因片段為序列模板，依據(jù)RACE引物設(shè)計(jì)原則和要求設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE基因特異引物 （見(jiàn)表1），使用SMARTERTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒進(jìn)行RACE產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增，相關(guān)實(shí)驗(yàn)體系參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所有RT-PCR和RACE產(chǎn)物使用全式金EasyPure Quick Gel Extraction Kit試劑盒回收，回收產(chǎn)物連接PEASY-T5 Zero Cloning Kit載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取至少5個(gè)克隆交由深圳華大公司測(cè)序。將正確的RT-PCR擴(kuò)增片段和RACE擴(kuò)增序列拼接形成cDNA全長(zhǎng)序列，同時(shí)設(shè)計(jì)基因編碼區(qū)引物 （表1）擴(kuò)增甘蔗GT1基因的編碼區(qū)。所有的序列比對(duì)使用DNAMAN5.0軟件進(jìn)行，序列拼接使用Vector NTI 11.5軟件。

表1 甘蔗ScGT1基因克隆引物信息Table 1 The information of all primers used in cloning experiments of ScGT1

1.2.3 ScGT1生物信息學(xué)分析

使用NCBI網(wǎng)站在線工具ORF Finder查找ScGT1基因的開(kāi)放閱讀框和推導(dǎo)氨基酸序列，Conserved domain search 分析蛋白結(jié)構(gòu)域。 使用 ProtScale、ProtParam、SignaIP 4.1、ProtComp Version9.0、SOP-MA、phyre 2、ProtFun等在線蛋白分析軟件分析ScGT1蛋白的理化性質(zhì)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、核定位信號(hào)、二三級(jí)結(jié)構(gòu)及功能預(yù)測(cè)。然后在Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.Uniprot.org）中應(yīng)用BLASTp尋找并下載ScGT1同源蛋白序列，分別采用DNAman和MEGA7.0進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析，并構(gòu)建NJ（Neibor-joining）系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 ScGT1基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

根據(jù)高粱、玉米和小米GT1同源基因保守區(qū)設(shè)計(jì)的RT-PCR引物都可擴(kuò)增出片段，如圖1-A所示，其中引物ScGT1-29-F與ScGT1-654-R獲得一條較大的片段，經(jīng)回收測(cè)序，片段大小為629 bp，與高粱、玉米和小米GT1同源基因序列比對(duì)，一致性分別達(dá)到96%、93%和91%，確定為甘蔗GT1基因的RT-PCR擴(kuò)增片段。為了獲得該基因片段兩端序列，使用3′RACE引物ScGT1-398-F和ScGT1-518-F經(jīng)兩輪PCR擴(kuò)增獲得比對(duì)正確的3′端片段序列，長(zhǎng)度為638 bp（圖1-B）；再使用5′RACE引物ScGT1-425-R和ScGT1-222-R經(jīng)兩輪PCR擴(kuò)增獲得比對(duì)正確的5′端片段序列，長(zhǎng)度為559 bp（圖1-C）。使用Vector NTI 11.5軟件里的ContigExpress程序?qū)T-PCR基因片段、3′RACE產(chǎn)物和 5′RACE產(chǎn)物拼接后得到全長(zhǎng)為1469 bp的cDNA序列。使用編碼區(qū)擴(kuò)增引物PCR擴(kuò)增可獲得一條長(zhǎng)度為1214 bp的序列（圖1-D），與高粱、玉米和小米GT1同源基因序列比對(duì)，一致性分別達(dá)到93%、85%和87%。該cDNA序列包含286 bp的5′UTR序列，723 bp的編碼區(qū)序列，460 bp的3′UTR序列，命名為ScGT1，并上傳GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，編號(hào)為MK318528。

圖1 ScGT1 PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.1 The PCR amplification picture of ScGT1 geneA：RT-PCR 產(chǎn)物；B：3′RACE 產(chǎn)物；C：5′RACE 產(chǎn)物；D：編碼區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物A:the RT-PCR product;B:the 3′RACE product;C:the 5′RACE product;D:The PCR product of code region

圖2 ScGT1基因推導(dǎo)出的氨基酸序列Fig.2 The derived amino acid sequence of ScGT1▲：起始密碼子；*：終止密碼子▲:the initiation codon;*:the termination codon

2.2 ScGT1的生物信息學(xué)分析

2.2.1 ScGT1編碼氨基酸序列結(jié)構(gòu)

應(yīng)用NCBI在線ORF Finder程序分析ScGT1的cDNA序列，獲得長(zhǎng)723 bp的ORF，起始密碼子ATG位于161 bp處，終止密碼子TGA位于883 bp處，共編碼240個(gè)氨基酸（圖2）。

2.2.2 ScGT1保守結(jié)構(gòu)域和理化性質(zhì)分析

使用NCBI Conserved domain search在線工具分析ScGT1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，該蛋白包含1個(gè)保守結(jié)構(gòu)域Homeodomain，屬于Homeodomain超級(jí)家族（圖3），Homeodomain域上分布有特異性堿基接觸位點(diǎn)和DNA binding位點(diǎn)，主要參與植物關(guān)鍵發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。使用ProtParam和ProtScale工具預(yù)測(cè)ScGT1蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，該蛋白分子質(zhì)量約為26.44 kDa、理化等電點(diǎn)pI為6.04、分子式C1151H1814N336O362S9；在組成該蛋白的 20種氨基酸中丙氨酸（Ala）所占比例最高（14．2%），其次為谷氨酸（Glu），占 10．8%，而異亮氨酸（Ile）和色氨酸（Trp）所占比例最低（0．4%）；不穩(wěn)定指數(shù)為 60．49（＞40），為不穩(wěn)定蛋白，脂肪指數(shù)為 62．79?？偲骄H水性-0．622，從親/疏水信號(hào)圖（圖 4）來(lái)看，第 163 位具有最高分值（2．078），疏水性最強(qiáng)，第 42 位具有最低分值（-4．000），大部分的氨基酸處于0值以下，推測(cè)其可能是親水蛋白。

圖3 ScGT1蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved domain prediction of ScGT1 protein

圖4 ScGT1氨基酸序列的親/疏水性預(yù)測(cè)Fig.4 Hydrophilic/hydrophobic prediction of the amino acid sequence of ScGT1 protein

圖5 ScGT1跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.5 The prediction of transmembrane domain and signal peptide for ScGT1 protein

2.2.3 ScGT1跨膜結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽預(yù)測(cè)和蛋白亞細(xì)胞定位

跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分析結(jié)果表明ScGT1蛋白1～240位氨基酸都位于細(xì)胞膜表面（圖5），不存在跨膜結(jié)構(gòu)，不屬于膜受體蛋白，不參與細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)；第24位丙氨酸（Ala）殘基具有最高的剪切位點(diǎn)分值（0．124）和最高的綜合剪切點(diǎn)分值（0．125），第 21位丙氨酸（Ala）殘基具有最高的信號(hào)肽分值（0．169）；由于最后算得的信號(hào)肽平均值較小，為0．127（遠(yuǎn)小于0．5），因此推測(cè)ScGT1為非分泌蛋白，不存在信號(hào)肽。亞細(xì)胞定位分析表明ScGT1蛋白位于細(xì)胞核、微體、線粒體基質(zhì)空間、葉綠體類(lèi)囊體膜的概率分別為70．0%、30．4%、10．0%和10．0%，推測(cè)其主要分布在細(xì)胞核。

2.2.4 ScGT1的二級(jí)結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)

使用SOPMA軟件預(yù)測(cè)ScGT1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示，該蛋白主要由α-螺旋（h）、無(wú)規(guī)則卷曲（c）、β-折疊（e）、和 β-轉(zhuǎn)角（t）構(gòu)成，其中 α 螺旋最多，比例為 49．17%，其次為無(wú)規(guī)則卷曲（34．17%）和 β-折疊（10.42%），β-轉(zhuǎn)角最少，為6.25%。使用ProtFun 2.2預(yù)測(cè)ScGT1蛋白功能，結(jié)果表明該蛋白主要參與氨基酸生物合成（可能性值最高，為3.539）。

圖6 ScGT1二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 The secondary structure prediction of ScGT1 proteinh：α 螺旋；e：β-折疊；c：無(wú)規(guī)則卷曲；t：β-轉(zhuǎn)角h:alpha helix,e:beta-fold,c:random curl,t:beta-turn

2.2.5 ScGT1的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用反射折疊法構(gòu)建ScGT1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。根據(jù)phyre 2軟件預(yù)測(cè)結(jié)果可知ScGT1空間結(jié)構(gòu)以螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主（見(jiàn)圖7）。將該蛋白與高粱、玉米和水稻GT1蛋白（XP002465695.1、NP001142313.1和XP015629042.1）的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)圖進(jìn)行比較，結(jié)果顯示它們的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)存在小的差異，整體上較相似。

圖7 ScGT1三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 The third structure prediction of ScGT1 protein

圖8 ScGT1與幾種禾本科植物同源蛋白質(zhì)序列比對(duì)圖Fig.8 Alignment map of ScGT1 with homologous protein sequences of several gramineous plants

2.2.6 ScGT1同源性分析

利用ScGT1編碼蛋白在Uniprot中搜索比對(duì)發(fā)現(xiàn)，ScGT1編碼蛋白與高粱、玉米、黍（Panicum hallii）、二香皮寡毛魚(yú)草（Dichanthelium oligosanthes）、小米、水稻等單子葉禾本科植物的HD-Zip I家族基因序列一致性較高，分別是93%、88.9%、87.6%、87.5%、87.2%、73.6%。DNAman軟件比對(duì)可知（圖8），它們的氨基酸序列整體上較為相似，其中Homeodomain結(jié)構(gòu)域十分保守，變異較少，其次為Coiled coil結(jié)構(gòu)區(qū)，Low complexity結(jié)構(gòu)區(qū)變異較為豐富些，甘蔗在此結(jié)構(gòu)區(qū)前段存在2個(gè)氨基酸（DS）的插入，水稻在此結(jié)構(gòu)末端存在6個(gè)氨基酸（AAAALA）的插入。

圖9 ScGT1與其它禾本科植物同源基因蛋白的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.9 The NJ phylogenetic tree of ScGT1 and other gramineous plant homologous proteins

另外，使用MEGA7.0構(gòu)建了ScGT1和其它9種禾本科植物HD-Zip I家族基因的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖9所示。10種蛋白可聚為2個(gè)組，一組主要由HD-Zip I家族的gt1 Clade組成，另一組主要由HD-Zip I家族的Vrs1 Clade組成。甘蔗GT1蛋白聚在gt1 Clade類(lèi)群，且跟高粱和玉米的GT1同源蛋白表現(xiàn)出較近的同源關(guān)系。該類(lèi)群基因主要參與腋分生組織的發(fā)育調(diào)控，推測(cè)甘蔗ScGT1也可能參與了腋分生組織的調(diào)控，從而影響甘蔗的分蘗表型。

3 討論

高的蔗莖產(chǎn)量一直是甘蔗品種選育的重要育種目標(biāo)，為了培育高產(chǎn)品種，育種者對(duì)于品系材料的分蘗特性十分關(guān)注。為了進(jìn)一步提高強(qiáng)分蘗高產(chǎn)品種的選擇效率，加大對(duì)分蘗性狀的分子基礎(chǔ)解析，同時(shí)挖掘優(yōu)異分蘗相關(guān)基因，然后通過(guò)分子技術(shù)手段調(diào)控品種分蘗性狀的表現(xiàn)，最終實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)是改良品種產(chǎn)量潛力十分重要的途徑之一。

HD-Zip I家族基因是一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其成員參與了植物的發(fā)育調(diào)控和逆境脅迫響應(yīng)[22]。玉米GT1基因是HD-Zip I同源基因，參與玉米腋芽休眠、避蔭響應(yīng)以及最終的株型建成和產(chǎn)量構(gòu)成，屬于分蘗負(fù)調(diào)控基因[20]。本研究通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)從甘蔗中克隆出GT1的同源基因，該基因具723 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼240個(gè)氨基酸，比玉米GT1蛋白氨基酸數(shù)多1個(gè)，都具有Homeodomain保守結(jié)構(gòu)域且三級(jí)結(jié)構(gòu)較為相似，同時(shí)分子量、理化等電點(diǎn)和總平均親水性值只有微小的差異，表明甘蔗和玉米GT1基因在序列、結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上十分相似。亞細(xì)胞定位分析表明該蛋白可能定位于細(xì)胞核，這與Whipple等[20]報(bào)道的玉米GT1亞細(xì)胞定位結(jié)果一致。

同源分析表明，甘蔗GT1蛋白與高粱、玉米、小米、水稻等禾本科植物同源蛋白氨基酸序列結(jié)構(gòu)一致性較高，在HD-Zip I家族蛋白的主要結(jié)構(gòu)域（Homeodomain）上表現(xiàn)出高度的保守性，該結(jié)構(gòu)主要功能為參與植物關(guān)鍵發(fā)育過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[23]，由此表明甘蔗GT1基因也可能參與了甘蔗關(guān)鍵發(fā)育過(guò)程的調(diào)控，但因在其它結(jié)構(gòu)上與其它禾本科植物存在一定變異，可能導(dǎo)致一些小的功能分化。根據(jù)前人研究報(bào)道，HD-Zip I家族存在兩個(gè)旁系同源類(lèi)群，分別為gt1 Clade和Vrs1 Clade，兩個(gè)類(lèi)群的基因都可抑制植物腋分生組織的發(fā)育，但gt1 Clade主要抑制營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)發(fā)育，Vrs1 Clade抑制花穗的發(fā)育[9，20]，針對(duì)ScGT1的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明該蛋白聚在gt1 Clade，由此推測(cè)，該基因可能像玉米的GT1基因一樣參與了分蘗性狀的調(diào)控，后續(xù)應(yīng)使用基因工程手段進(jìn)行功能驗(yàn)證。同時(shí)鑒于該基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控的下游基因是什么，處于哪條代謝途徑上，將成為后續(xù)研究的重點(diǎn)方向。