三氧化二砷對小鼠B16細(xì)胞p53、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響*

黃 樺 朱 紅 高 潔

1 蚌埠醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室 蚌埠 233030；2 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科；3 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科；

惡性黑素瘤是由皮膚和其他器官黑素細(xì)胞惡變而來的一種惡性程度很高的皮膚腫瘤[1]。惡性黑素瘤不僅可發(fā)生于全身的皮膚、黏膜組織，并可隨血液和淋巴轉(zhuǎn)移至全身各器官。由于惡性黑素瘤的惡性程度高、易多發(fā)，且黑素瘤細(xì)胞的增殖性、侵襲性和黏附性均很強，導(dǎo)致惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生早，易轉(zhuǎn)移。早期惡性黑素瘤采用手術(shù)治療能得到較好的治療效果，但腫瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)手術(shù)治療及化療的效果就會很差，患者的五年生存率很低[2]。

砷劑治療惡性腫瘤的分子機(jī)理主要在于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡、自噬、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、影響腫瘤組織血管生成等。有報道[3-6]稱，砷劑誘導(dǎo)凋亡的機(jī)理與干擾細(xì)胞線粒體呼吸鏈活性、降低線粒體跨膜電位、增加細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、阻滯細(xì)胞周期、活化Caspase家族蛋白、下調(diào)NF-κB及Survivin等蛋白的表達(dá)和抑制細(xì)胞端粒酶活性等密切相關(guān)。但應(yīng)用砷劑治療惡性黑素瘤的實驗研究國內(nèi)外文獻(xiàn)報道較少。本研究選用小鼠B16細(xì)胞株為研究對象，探討不同濃度的As2O3對細(xì)胞凋亡及p53、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響，探討As2O3引起惡性黑素瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 B16細(xì)胞株(購自中科院細(xì)胞所)，胰蛋白酶，RPMI-1640培養(yǎng)基，胎牛血清(美國GIBCO公司)，As2O3(美國SIGMA公司)，吖啶橙(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，Bcl-2蛋白和Bax蛋白兔抗鼠多克隆抗體(美國Santa Cruz 公司)，p53蛋白和GAPDH蛋白羊抗鼠單克隆抗體(美國Santa Cruz 公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 B16細(xì)胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置37℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d傳代一次。取對數(shù)生長期細(xì)胞，用含2.0 g/L胰酶和0.5 mmol/L EDTA的培養(yǎng)液進(jìn)行消化，利用細(xì)胞計數(shù)盤調(diào)整細(xì)胞終濃度為1.5×108/L，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h至細(xì)胞處于對數(shù)生長期，將細(xì)胞分為三組，有兩組分別換入As2O3終濃度分別為10、20 mmol/L的培養(yǎng)液，對照組不加藥，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 分別采用吖啶橙染色(acridine orange，AO，5 mg/mL)和吉姆薩染色鏡下觀察對照組和10、20 mmol/L As2O3作用下B16細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.4 Western blot檢測p53、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá) 采用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，并檢測蛋白含量。取40 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。封閉液封閉2 h，4℃條件下一抗(1∶1 000)孵育過夜，洗滌后再加入相應(yīng)二抗，37 ℃條件下孵育2 h。以GAPDH為內(nèi)參照，將目標(biāo)條帶與GAPDH條帶 的吸光度比值作為相應(yīng)蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)均以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用SPSS 16.0行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài) 倒置顯微鏡下可見對照組細(xì)胞正常貼壁生長，細(xì)胞形態(tài)基本一致，呈梭形；而藥物處理組的細(xì)胞形態(tài)由梭形變?yōu)閳A形。同時，20 μmol/L As2O3組的漂浮細(xì)胞較10 mmol/LAs2O3組的多，而貼壁細(xì)胞則出現(xiàn)減少的趨勢且細(xì)胞內(nèi)顆粒增多。從圖1可見吉姆薩染色顯示對照組B16細(xì)胞核呈圓形，細(xì)胞生長排列緊密且有交錯層疊現(xiàn)象。經(jīng)10 μmol/L As2O3作用后的B16細(xì)胞形態(tài)及生長速度未受到顯著影響。經(jīng)20 μmol/L As2O3作用后的B16細(xì)胞形態(tài)逐漸變得不規(guī)則，同時細(xì)胞變小，相等視野下細(xì)胞數(shù)量減少。

A 對照組；B 10 μmol/L As2O3作用24 h組；C 20 μmol/L As2O3作用24 h組。

圖1 吉姆薩染色觀察As2O3作用后B16細(xì)胞形態(tài)變化(×400)

2.2 吖啶橙染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 吖啶橙染色結(jié)果顯示對照組細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則且完整，在鏡下呈均勻綠染；經(jīng)10 μmol/L As2O3作用后細(xì)胞核形態(tài)未見受到顯著影響；20 μmol/L As2O3作用后的B16細(xì)胞的細(xì)胞核均有破裂，核質(zhì)濃縮等現(xiàn)象。細(xì)胞核呈不規(guī)則的、大小不等、致密濃染的黃綠色顆粒狀或塊狀熒光(圖2)。

A 對照組；B 10 μmol/L As2O3作用24 h組；C 20 μmol/L As2O3作用24 h組。

圖2 吖啶橙染色觀察As2O3作用后B16細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化(×200)

2.3 Western blot檢測p53、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)變化可見，與對照組相比，As2O3作用后，B16細(xì)胞中p53、Bax蛋白的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白的表達(dá)下調(diào)(圖3)。

p53蛋白的相對光密度比值在對照組、10 μmol / L As2O3組、20 μmol / L As2O3組分別是5.04±0.73、12.41±1.31、22.21±1.26；Bcl-2蛋白的相對光密度比值在上述三組中分別是45.53±1.29、25.33±1.23、10.38±1.25；Bax蛋白的相對光密度比值在上述三組中分別是29.63±0.57、35.32±0.56、44.17±1.01。三組之間進(jìn)行兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

1 對照組；2 10 μmol/L As2O3作用24 h組；3 20 μmol/L As2O3作用24 h組。

圖3 Western blot檢測As2O3作用后B16細(xì)胞的p53、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)變化

圖4 Western blot檢測As2O3作用后B16細(xì)胞的p53、Bcl-2、Bax蛋白與GAPDH的相對光密度比值

注：*P<0.05；**P<0.01。

3 討論

砷在自然界中主要以與氧或硫結(jié)合的形式存在，其主要毒理機(jī)制在于與巰基的親和力很強，可影響體內(nèi)多種酶的活性，特別是參與細(xì)胞能量代謝及DNA合成與修復(fù)的酶。在歷史上，砷留給人們的印象更多的是一種毒物；但是我國學(xué)者卻打破傳統(tǒng)認(rèn)知，應(yīng)用砷劑作為抗腫瘤藥物臨床治療白血病，并且取得了較好的療效[7]。同時，As2O3對其他腫瘤是否也有類似作用，這也是人們感興趣的問題。目前，有其他研究報道，As2O3可以引起人乳腺癌細(xì)胞、非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞的凋亡和自噬，并抑制其增殖[8-10]。

細(xì)胞凋亡是一種程序性死亡，在這一過程中機(jī)體主動清除多余細(xì)胞和“缺陷”細(xì)胞。細(xì)胞凋亡對機(jī)體發(fā)育和自身穩(wěn)定均起到重要作用，是機(jī)體的一種重要防御機(jī)制。細(xì)胞凋亡異常是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制。在正常機(jī)體中，細(xì)胞增殖和凋亡之間維持著一種平衡。而一旦細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡遭到破壞，細(xì)胞凋亡受到抑制，腫瘤便會迅速生長。對腫瘤進(jìn)行的各種治療歸根結(jié)底均與抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。本課題組前期的研究結(jié)果表明，As2O3可以抑制小鼠惡性黑素瘤的生長。但不同濃度的As2O3其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用不盡相同，其中較高劑量的As2O3對B16細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用較強，而低劑量的As2O3則效果不顯著[11]。細(xì)胞凋亡的顯著特征之一就是細(xì)胞核的形態(tài)發(fā)生一系列的改變，本次實驗結(jié)果表明，As2O3作用B16細(xì)胞后，會引起B(yǎng)16細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生一系列的改變。

腫瘤細(xì)胞的生長增殖過程受到多種因素的調(diào)控。常見的腫瘤抑制基因有p53、Bax、Caspase等，原癌基因有Bcl-2、NF-κB、Survivin等。Caspase家族蛋白是目前已知最強的促凋亡蛋白。引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，繼而產(chǎn)生凋亡的重要機(jī)制之一就是，本來位于線粒體中的細(xì)胞色素C在多種因素的作用下，從線粒體中釋放出來，刺激凋亡體的形成，進(jìn)而激活Caspase家族。Bcl-2是目前已知的重要的抗凋亡蛋白，其發(fā)揮抗凋亡作用的機(jī)制之一就是阻止細(xì)胞色素C從線粒體釋放出來；同時，作為與Bcl-2屬于同一蛋白家族的Bax卻是促凋亡蛋白，能夠?qū)cl-2 產(chǎn)生阻抑作用。Bax可以形成寡聚體，從細(xì)胞漿中轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，和Bcl-2形成多聚體，增強線粒體的通透性，最終誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體中釋放，產(chǎn)生促進(jìn)凋亡作用。p53可以誘導(dǎo)Bax的表達(dá)，以及抑制Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而使得線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的電位差消失，線粒體膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體中釋放出來，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。已有研究[12]報道，As2O3能夠通過影響p53、Bcl-2、Bax等多種凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)腸癌等腫瘤細(xì)胞的凋亡。通過對小鼠正常黑色素細(xì)胞和B16細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的比較可以看出，NF-κB、Bcl-2、Bax等蛋白mRNA的表達(dá)差異顯著[13]。而本次實驗結(jié)果表明，As2O3可使B16細(xì)胞株p53、Bax蛋白的表達(dá)增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)下降。

As2O3作用于B16細(xì)胞后會引起細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生一系列的改變，同時誘導(dǎo)p53、Bax蛋白的表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)。在小鼠正常黑色素細(xì)胞和B16細(xì)胞之間，上述三種蛋白的表達(dá)差異顯著，所以上述三種蛋白在惡性黑素瘤的腫瘤進(jìn)程中占有重要的地位。本次研究的結(jié)果將為臨床治療惡性黑素瘤和開發(fā)砷劑藥物提供進(jìn)一步的理論和實驗基礎(chǔ)。