P2X7受體與白血病關(guān)系的研究進展

李明萱，羅淑萍，趙榮蘭，彭效祥

(濰坊醫(yī)學(xué)院 臨床檢驗診斷學(xué)山東省“十二五”高校重點實驗室，山東濰坊261053)

ATP作為一種核苷酸，可參與細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，其受體被命名為2型嘌呤能受體家族(P2)受體，其中嘌呤能離子通道型7(P2X7)受體的生理功能有著重要意義，免疫學(xué)研究也最廣泛[1]。P2X7受體廣泛表達于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。P2X7受體激活的失衡可能導(dǎo)致多種病理反應(yīng)，包括感染、炎癥性疾病、神經(jīng)退行性疾病和癌癥等。研究表明，P2X7受體的激活可以加快或改善疾病進程[2]。近年來，P2X7受體在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到關(guān)注，P2X7受體在白血病患者特別是復(fù)發(fā)患者的骨髓單核細(xì)胞中高表達，表明P2X7受體的過度表達可能是一個不良的預(yù)后因素。P2X7受體激活后可促進白血病細(xì)胞增殖或引發(fā)細(xì)胞死亡，因此P2X7受體介導(dǎo)的嘌呤能信號通路是治療白血病的潛在藥物靶點。本文就P2X7受體在白血病中的作用及其機制的研究進展予以綜述，以期為白血病治療提供新靶點和新策略。

1 P2X7受體的基本結(jié)構(gòu)和特征

P2X7受體包括一個由285個氨基酸組成的龐大、糖基化和富含半胱氨酸的胞外結(jié)構(gòu)域，兩個跨膜的TM1和TM2結(jié)構(gòu)域，一個短的胞內(nèi)N末端和一個胞內(nèi)長C末端。其中人P2X7受體中的TM1和TM2結(jié)構(gòu)域分別由殘基T28-S47和N332-L354組成[3]。與其他P2X受體相比，P2X7受體具有長的胞內(nèi)C末端，它參與了與P2X7受體相關(guān)的大部分功能，該區(qū)域不同部位的突變與多種生理功能的喪失有關(guān)，如脂多糖的結(jié)合、翻譯后修飾、膜靶向和大孔的形成等[4]。盡管少量證據(jù)表明P2X7受體可能聚集形成六聚體，但大量證據(jù)支持三聚體結(jié)構(gòu)[5]。

2 P2X7受體的基本功能

P2X7受體是一種ATP門控陽離子通道，在短暫刺激下形成選擇性陽離子通道，允許Na+、Ca2+和K+的內(nèi)流。P2X7受體激活后可產(chǎn)生促進和抑制效應(yīng)，主要依賴于激動劑刺激的強度和持續(xù)時間、細(xì)胞類型、細(xì)胞外離子濃度和基因多態(tài)性等。P2X7受體在淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的活化和樹突狀細(xì)胞免疫應(yīng)答的啟動中起重要作用[6]。P2X7受體參與IL-18分泌和單核細(xì)胞中IL-1β的成熟和釋放，以及巨噬細(xì)胞自噬作用的調(diào)控。此外，P2X7受體在激活T細(xì)胞和抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的免疫抑制潛力方面發(fā)揮了重要作用[7]。P2X7受體的激活是免疫細(xì)胞凋亡的重要機制，包括胸腺細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞。細(xì)胞間聯(lián)系能夠產(chǎn)生足夠的細(xì)胞外ATP來激活P2X7受體和觸發(fā)下游信號通路，包括膜金屬蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶(Caspases)，最終導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡。在P2X受體中，P2X7受體表現(xiàn)為雙功能分子：低濃度的ATP打開陽離子通道會導(dǎo)致細(xì)胞增殖，而高濃度的ATP打開大孔釋放炎性細(xì)胞因子，可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[5,8,9]。大孔道負(fù)責(zé)大多數(shù)P2X7受體依賴性的功能，以前認(rèn)為大孔道并非P2X7受體本身所固有，其形成需要輔助蛋白的參與和持續(xù)的刺激。2017年的研究表明，大孔道是P2X7受體固有的，受體受到刺激后立即被激活。近年研究發(fā)現(xiàn)，這個孔道的打開與它獨特的C端無關(guān)，P2X7受體通道的活性主要取決于膽固醇與跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域的直接相互作用，但磷脂酰甘油和鞘磷脂也有促進作用[10,11]。惡性腫瘤普遍過表達P2X7受體，是P2X7受體發(fā)揮雙重功能的典型代表。

3 P2X7受體在白血病發(fā)病中的作用

3.1 P2X7受體參與白血病細(xì)胞增殖 在P2X受體亞群中，P2X7受體與細(xì)胞增殖的關(guān)系最密切[11]。以往研究顯示，在不表達P2X7受體的白血病細(xì)胞系K562和LG14中，過表達P2X7受體可促進細(xì)胞增殖。此外，急性淋巴細(xì)胞白血病和其他類型白血病患者骨髓來源的單個核細(xì)胞中，P2X7受體的表達明顯高于健康對照組。在慢性B淋巴細(xì)胞白血病(B-CLL)中，P2X7受體表達與發(fā)病率的增加相關(guān)，這表明P2X7受體賦予腫瘤細(xì)胞生長優(yōu)勢。正常T細(xì)胞受到抗原刺激后會釋放大量ATP到胞外，刺激P2X受體激活自分泌信號通路調(diào)節(jié)鈣離子內(nèi)流，產(chǎn)生包括細(xì)胞增殖在內(nèi)的多種功能。Ledderose等[12]提出嘌呤能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制中的缺陷是否與白血病T細(xì)胞的有害增殖有關(guān)，他們發(fā)現(xiàn)與正常T細(xì)胞相比，急性白血病T細(xì)胞(Jurkat)擁有數(shù)量龐大、活性更高的線粒體，并且與未受刺激的正常T細(xì)胞相比，Jurkat胞內(nèi)ATP濃度更高，釋放更多的ATP，由此導(dǎo)致的自分泌嘌呤能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的增強可維持線粒體的高活性，構(gòu)成了一個反饋回路；進一步研究發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)性ATP持續(xù)刺激P2X1和P2X7受體導(dǎo)致了嘌呤能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的紊亂，進而造成了白血病細(xì)胞的無限增殖，在白血病細(xì)胞系THP-1、U-937和HL-60也觀察到不同程度的大量增殖現(xiàn)象。另外，不同于正常T細(xì)胞，上述白血病細(xì)胞系的增殖不需TCR/CD28 的刺激。進一步研究發(fā)現(xiàn)，進展型B-CLL的靜息鈣離子濃度顯著高于懶惰型，并且前者P2X7受體激活會觸發(fā)更多的鈣離子內(nèi)流。高水平的鈣離子內(nèi)流與進展型B-CLL患者淋巴細(xì)胞P2X7受體表達增加有關(guān)。ATP培養(yǎng)可以減少進展型患者淋巴細(xì)胞的自發(fā)性增殖，但對懶惰型患者的淋巴細(xì)胞沒有影響，表明 P2X7受體的表達賦予進展型B-CLL細(xì)胞增殖優(yōu)勢，但也使這些細(xì)胞更容易受到胞外高濃度ATP的細(xì)胞毒性作用的影響。另一方面，這些結(jié)果提示P2X7受體的表達和功能可能與B-CLL的預(yù)后有關(guān)[13]。P2X7受體在CLL患者的外周血淋巴細(xì)胞中過表達。Salaro等[14]研究了23例CLL患者的淋巴細(xì)胞P2X7-炎性復(fù)合體隱熱蛋白(NLRP3)軸，發(fā)現(xiàn)P2X7受體和凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)均過表達，而NLRP3與正常對照相比顯著下調(diào)；進一步研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3沉默會增強P2X7受體的表達和促進細(xì)胞生長，相反NLRP3過表達會刺激Caspase的活性而加速細(xì)胞死亡；這些發(fā)現(xiàn)提示，NLRP3是生長的負(fù)調(diào)控因子，并指出了P2X7/NLRP3軸在CLL中的作用。研究表明，所有造血細(xì)胞均表達P2X7受體，然而不同譜系和不同分化階段的細(xì)胞表達水平不同；造血干細(xì)胞(HSCs)P2X7受體的表達水平最低，表達水平隨著分化程度的增加而增加。這些結(jié)果提示，P2X7受體在細(xì)胞不同分化階段發(fā)揮不同的作用。P2X7受體在造血干/祖細(xì)胞(HSPCs)中過表達可導(dǎo)致體外集落單位形成能力下降和體內(nèi)移植潛力下降，表明高水平的P2X7受體介導(dǎo)的嘌呤能信號是HSPCs擴增的負(fù)調(diào)控因子，且其在從正常HSPCs到造血干細(xì)胞白血病前期干細(xì)胞或白血病干細(xì)胞(LSCs)的克隆進化過程中并無擴增優(yōu)勢。雖然其機制尚不清楚，但通過阻斷P2X7受體介導(dǎo)的嘌呤能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是促進HSPCs擴增的一種方法[7]。

3.2 P2X7受體參與白血病細(xì)胞凋亡 作用于P2X受體或P2Y受體的胞外ATP還可通過不同途徑(凋亡、壞死和焦亡)觸發(fā)癌細(xì)胞死亡，這取決于ATP濃度和細(xì)胞類型。典型的細(xì)胞毒性P2受體為P2X7受體[11]。P2X7受體是一種不尋常的受體，ATP誘導(dǎo)的大量激活導(dǎo)致非選擇持續(xù)開放的膜孔道的形成，進一步觸發(fā)細(xì)胞死亡信號。最近研究表明，高水平的ATP在一些腫瘤細(xì)胞中顯示出直接的細(xì)胞毒效應(yīng)。急性髓細(xì)胞白血病(AML)細(xì)胞表達高水平的P2X7受體，Salvestrini等[15]首次報道白血病干/祖細(xì)胞也表達P2X7受體，發(fā)現(xiàn)大劑量的ATP激活P2X7受體可有效地誘導(dǎo)LSCs凋亡，但是這種細(xì)胞毒作用對正常造血干/祖細(xì)胞沒有影響，認(rèn)為ATP活化P2X7受體可在LSC水平誘導(dǎo)AML的治療反應(yīng)，并且不會對正常造血干細(xì)胞造成影響。這些結(jié)果為開發(fā)AML新療法提供了證據(jù)。

3.3 P2X7受體基因多態(tài)性變化 在人類P2X7受體的表達中，各種P2X7單核苷酸多態(tài)性的遺傳對功能的喪失或獲得以及疾病關(guān)聯(lián)的影響各不相同。具有家族遺傳背景的CLL發(fā)病率幾乎是普通群體的3倍，其中一個誘發(fā)因素可能是淋巴細(xì)胞凋亡機制遺傳失敗。為了確定單核苷酸的多態(tài)性(SNP)形成的功能喪失型P2X7受體，進而導(dǎo)致促凋亡信號通路的缺陷是否存在于CLL患者的B淋巴細(xì)胞，Wiley等[16]研究發(fā)現(xiàn)，CLL患者1 513A→C的基因突變率和突變頻率均為正常對照組的3倍；通過分析ATP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，確證了1個或2個P2X7受體不活躍等位基因的存在降低了ATP誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞凋亡的敏感性，這可能導(dǎo)致體內(nèi)B淋巴細(xì)胞生存期延長；他們還提出CLL患者中雜合子無功能性P2X7受體等位基因的普遍增加，將使P2X7受體基因成為一個新的腫瘤抑制基因，其中P2X7受體的單倍劑量不足是CLL發(fā)病的早期危險因素。外顯子13(1 513A/C)是P2X7受體基因的一個常見SNP位點，它可編碼功能活躍和無功能的蛋白，1 513A→C可導(dǎo)致P2X7受體功能缺失，但不影響其表達。Nückel等[17]研究發(fā)現(xiàn)，慢性淋巴細(xì)胞白血病患者與正常對照組的P2X7受體1 513A/C基因頻率并無顯著差異，與已知的CLL預(yù)后因子如CD38的表達、VH基因突變狀態(tài)和ZAP-70的表達相比，P2X7受體的基因多態(tài)性在判斷預(yù)后中的意義不大。一些基因多態(tài)性與P2X7受體活性的增強有關(guān)，例如Ala348Thr多態(tài)性，與野生型相比，其活性增加了3倍。Koldej等[18]研究發(fā)現(xiàn)，具有SNP Gln460Arg的同種異體造血干細(xì)胞供者在粒細(xì)胞集落刺激因子作用下，能夠顯著增強CD34+造血干細(xì)胞的動員，而功能缺失或獲得型P2X7 SNPs與CD34+HSC動員之間沒有明顯的聯(lián)系，表明P2X7受體的表達可能通過促進骨髓G-CSF介導(dǎo)的炎癥和增強中性粒細(xì)胞彈性酶介導(dǎo)的HSC的釋放，來影響同種異體供體的HSC動員效率。如果在更大的隊列中驗證了這個結(jié)果，可能會為骨髓捐助增加一個新的篩選標(biāo)準(zhǔn)。馮麗等[19]成功構(gòu)建野生型及N187D突變型P2X7與Notch1胞內(nèi)區(qū)片段(ICN1)基因的共表達載體，并在白血病細(xì)胞中表達，為進一步探討P2X7受體在白血病發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。

4 P2X7受體與白血病治療

白血病治療多藥方案中使用的化療藥物包括甲氨蝶呤、6-巰基嘌呤(6-MP)和氟達拉濱，它們都以嘌呤代謝為靶向。研究發(fā)現(xiàn)，6-MP(500 nmol/L)和蘇拉明(200 μmol/L)有相似的抗增殖作用，與未經(jīng)治療的對照組相比，Jurkat細(xì)胞減少了多達80%。重要的是，蘇拉明和6-MP的聯(lián)合應(yīng)用增加了單種藥物的抗增殖潛力，并且完全阻止了細(xì)胞增殖。另外，與6-MP聯(lián)合蘇拉明相比，6-MP與P2X1受體特異性抑制劑NF023或P2X7受體特異性抑制劑A438079的聯(lián)合應(yīng)用可引起類似但稍弱的反應(yīng)。研究還表明，P2X1或P2X7受體抑制劑聯(lián)合化療藥物6-MP可完全阻斷Jurkat細(xì)胞的增殖，低毒性劑量的蘇拉明或特異性P2X受體抑制劑可與其他化療藥物(如6-MP)聯(lián)合使用。嘌呤能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制可能是提高ALL化療治療效果的潛在藥物靶點。而不同癌細(xì)胞系對嘌呤能抑制劑的敏感性不同，可以用之前在這些不同癌細(xì)胞系中描述的線粒體功能差異來解釋[12]。一些制藥和生物技術(shù)公司已經(jīng)開發(fā)出針對P2X7受體的小分子抑制劑或抗體，其中一些化合物已被用于治療某些慢性炎癥性疾病的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗，并已顯示出可接受的耐受性和安全性。目前在P2受體中，靶向P2X7和P2Y12受體的癌癥治療具有最佳前景[11]?；|(zhì)激活的AML細(xì)胞抗凋亡信號通路PI3K/AKT/mTOR可減弱白血病細(xì)胞對傳統(tǒng)化療的反應(yīng)，Bian等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤微環(huán)境中，胞外ATP可能處于較高水平，腫瘤細(xì)胞上P2X7激活后可同時阻斷AMPK-PRAS40-mTOR和PI3K/AKT信號通路的傳導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和生長抑制，最終可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。因此Salvestrini等[15]假設(shè)ATP可以干擾基質(zhì)誘導(dǎo)的AML細(xì)胞的抗凋亡信號，研究發(fā)現(xiàn)正?；|(zhì)和AML來源基質(zhì)均不影響ATP對白血病細(xì)胞的促凋亡作用，提示ATP治療AML可繞過基質(zhì)介導(dǎo)的耐藥。進一步研究發(fā)現(xiàn)，ATP聯(lián)合阿糖胞苷顯著增強了ATP的細(xì)胞毒作用，降低了殺死白血病細(xì)胞所需的化療藥物濃度。LSCs對現(xiàn)有治療方法的耐藥性以及藥物毒性是AML患者治療失敗的主要原因，尤其是老年人。這些數(shù)據(jù)可能對治療年老體弱的AML患者具有臨床意義，這些患者一般不適合標(biāo)準(zhǔn)劑量的化療。使用ATP作為常規(guī)化療藥物的佐劑可以降低其劑量和毒性，同時保持其治療效果。Lecciso等[21]研究表明，在柔紅霉素化療死亡的AML細(xì)胞中，其釋放的ATP可通過P2X7受體誘導(dǎo)DC的活化、成熟和IDO1的表達，而IDO1的上調(diào)可誘導(dǎo)免疫抑制性Treg細(xì)胞的產(chǎn)生，這將有助于在AML中創(chuàng)造一個免疫抑制的微環(huán)境來妨礙機體抗白血病的免疫反應(yīng)。因此，更好地了解在化療過程中誘導(dǎo)形成白血病免疫抑制微環(huán)境的機制，對充分利用抗白血病藥物的免疫潛能，以發(fā)揮更好的作用具有重要臨床意義。

5 小結(jié)與展望

癌癥與P2受體關(guān)系的相關(guān)研究中，P2X7受體似乎最吸引人的興趣，P2X7受體介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)復(fù)雜，激活P2X7受體可以促進細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，這兩種相反效應(yīng)的調(diào)控機制目前還不完全清楚。如處于胞外高ATP環(huán)境腫瘤細(xì)胞如何利用P2X7受體進行生長和擴散，同時又能不受細(xì)胞毒性非選擇性大孔(LP)的影響而存活下來，關(guān)于LP開放的分子機制和功能有待深入研究。另一方面，P2X7受體在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，它可以抑制一些腫瘤的生長，因此抑制P2X7受體后產(chǎn)生的免疫抑制是當(dāng)前面臨的重大問題。因此，使用P2X7受體拮抗劑成功治療癌癥的關(guān)鍵是選擇性地靶向癌細(xì)胞，同時不損害宿主免疫反應(yīng)。通過正向調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞LP的形成來觸發(fā)細(xì)胞死亡或增強免疫反應(yīng)來促進抗腫瘤反應(yīng)，可避免免疫抑制。關(guān)于P2X7受體參與癌癥的多項研究結(jié)果似乎相互矛盾，對于其表達、活性和作用的研究結(jié)果的爭議也最多；隨著對P2X7受體在白血病中作用機制的不斷深入研究，靶向P2X7受體治療白血病仍具有廣闊的發(fā)展前景。