外泌體在糖尿病性潰瘍中作用機(jī)制及應(yīng)用的研究進(jìn)展

袁佳沁, 宋福晨, 朱美冬, 李 琪, 王星皓, 張 磊

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 血管外科, 上海, 200437;2. 上海中醫(yī)藥大學(xué), 上海, 201203)

糖尿病性潰瘍是糖尿病較為嚴(yán)重的并發(fā)癥，發(fā)生率約15%。長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)會(huì)損害血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，引起神經(jīng)病變，易伴發(fā)感染[1]。臨床治療糖尿病性潰瘍通常采用手術(shù)清創(chuàng)、負(fù)壓引流及抗感染等方法[2], 但療效欠佳。近年來，外泌體在治療糖尿病及其并發(fā)癥中受到廣泛關(guān)注。外泌體廣泛存在于體液中，能夠?qū)膍RNAs、miRNAs和蛋白質(zhì)傳遞到靶細(xì)胞來調(diào)控細(xì)胞間的通訊，發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[3], 并參與多種病理生理過程，如腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移、炎癥反應(yīng)與免疫調(diào)節(jié)等[4]。研究[5- 6]表明，外泌體可以通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、加速血管生成等機(jī)制來促進(jìn)傷口愈合，這為今后防治糖尿病性潰瘍提供新的思路，故本文綜述如下。

1 外泌體介紹

1.1 外泌體的概念和來源

外泌體是最小的細(xì)胞外囊泡，大小在40～200 nm, 最初是由Pan等[7]于1983年從綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞中分離出來。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)幾乎所有的細(xì)胞都能夠分泌外泌體，包括正常上皮細(xì)胞[8]、干細(xì)胞[9]、腫瘤細(xì)胞[10]、肥大細(xì)胞[11]、脂肪細(xì)胞[12]等。不僅如此，外泌體還廣泛存在于各種體液中，如血漿、尿液、唾液和母乳[13]。

外泌體是通過內(nèi)體途徑在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的。首先，細(xì)胞的質(zhì)膜被內(nèi)化形成內(nèi)含體。隨后，蛋白質(zhì)和RNA(包括lncRNA、mRNA、miRNA和circRNA)通過內(nèi)含體分選復(fù)合物(ESCRT)依賴途徑或ESCRT非依賴途徑選擇性地被裝入多囊體(MVBs)中。最后，一部分多囊體通過與溶酶體結(jié)合而降解，而另一些多囊體則借由Rab27介導(dǎo)與質(zhì)膜相融合，并釋放到細(xì)胞外成為外泌體[14]。

1.2 外泌體的特征及功能

外泌體通常具有以下特征: 呈典型的球形或碟形，質(zhì)膜為脂質(zhì)雙分子層，含有豐富的膽固醇、鞘磷脂等脂質(zhì)成分，并攜帶有特異性蛋白質(zhì)、功能性mRNAs、miRNAs, 甚至DNA。因此，細(xì)胞間能夠通過外泌體進(jìn)行信息交流，并通過影響靶細(xì)胞的存活、增殖、遷移和基因表達(dá)以及通過重新編程供體細(xì)胞行為來調(diào)節(jié)許多生理和病理過程[15-16], 如免疫反應(yīng)、腫瘤擴(kuò)散、基因交換等。最新的研究[17]表明，外泌體還可以作為藥物投遞載體將抗腫瘤藥物針對(duì)性地傳遞至腫瘤細(xì)胞，從而提高化療效果，減輕副作用。

過去通常將跨膜蛋白(CD9、CD63和CD81)、熱休克蛋白(HSP70、HSP90)、主要組織相容性復(fù)合體(MHC)和腫瘤易感基因 101 蛋白(TSG101)作為識(shí)別外泌體的特異性蛋白。然而，最近的研究[18]認(rèn)為這些蛋白可能并不那么具有特異性。最近的一項(xiàng)研究[19]發(fā)現(xiàn)，這些蛋白不僅存在于外泌體中，而且也存在于微囊泡中。Jeppeen等[20]重新評(píng)估了外泌體組成，發(fā)現(xiàn)非外泌體細(xì)胞外囊泡可以通過膜聯(lián)蛋白A1和A2鑒定，并確定膜聯(lián)蛋白A1是直接從質(zhì)膜脫落的微泡的特異性標(biāo)記。故目前對(duì)于外泌體的特定蛋白標(biāo)志物尚未達(dá)成共識(shí)。

1.3 外泌體的分離和鑒定

目前常用超速離心法、密度梯度離心法、免疫親和法和超濾離心法等分離外泌體[21-22]。超速離心法是分離純化外泌體的“金標(biāo)準(zhǔn)”，通過低速離心與高速離心交替的方式得到大小相近的外泌體。超濾離心法利用不同截留相對(duì)分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜進(jìn)行選擇性分離。這2種方法操作簡(jiǎn)便，獲取量大，缺點(diǎn)在于純度常受到質(zhì)疑。密度梯度法的條件限制更嚴(yán)格，獲得的外泌體純度較高，但操作費(fèi)時(shí)、繁瑣。免疫親和法是用包被抗標(biāo)記物抗體的磁珠與外泌體孵育后結(jié)合，將外泌體吸附并分離出來。最近，微流體分離被認(rèn)為是一種很具前景的選擇性濃縮外泌體的方法，因其可以從少量液體樣品中快速、準(zhǔn)確地分離外泌體[23]。

通常使用電子顯微鏡[24]來觀察外泌體的形態(tài)，納米粒子追蹤分析(NTA)檢測(cè)外泌體的大小、分布和計(jì)數(shù)[25], ELISA和Western blot分析外泌體的蛋白質(zhì)含量和分子譜。以上3種方法相結(jié)合可有效地對(duì)外泌體進(jìn)行識(shí)別、鑒定。此外，流式細(xì)胞術(shù)可以通過識(shí)別單個(gè)外泌體上的標(biāo)記，有效地識(shí)別異質(zhì)外泌體群體中的癌細(xì)胞衍生外泌體[26]。因此，流式細(xì)胞術(shù)可能是鑒定外泌體的有效方法。

2 外泌體與糖尿病性潰瘍的關(guān)系

創(chuàng)面愈合是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，包括炎癥期、增殖期和瘢痕期3個(gè)不同但相互重疊的階段[27]。然而，糖尿病可以干擾這一過程，導(dǎo)致潰瘍難以愈合，目前其作用機(jī)制尚不清楚。最近的研究[28]發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面愈合上展示出巨大的優(yōu)勢(shì)，而MSCs釋放的可溶性介質(zhì)和旁分泌因子在創(chuàng)面愈合中起著關(guān)鍵作用[29]。故外泌體作為重要的旁分泌因子，可以影響創(chuàng)面愈合的多個(gè)過程，在糖尿病性潰瘍的修復(fù)中具有巨大潛力。

2.1 促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移

組織受損后，纖維細(xì)胞被招募到損傷部位，通過獲得成纖維細(xì)胞樣表型并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)成分和生長(zhǎng)因子來促進(jìn)組織修復(fù)。Walker等[30]研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者較正常人群的外周血中纖維細(xì)胞減少，晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)濃度增加，氧化應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈，并釋放更多的促炎細(xì)胞因子，這可能是導(dǎo)致糖尿病患者潰瘍創(chuàng)面難愈的原因。間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體具有逆轉(zhuǎn)這一過程的能力，有助于糖尿病性潰瘍創(chuàng)面愈合。Tao等[31]發(fā)現(xiàn)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(SMSCs)具有較強(qiáng)的促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖的能力。同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)[32]證實(shí)了富血小板血漿衍生外泌體(PRP-Exos)能促進(jìn)糖尿病大鼠模型慢性潰瘍創(chuàng)面微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)和成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，并釋放堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、人血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB(PDGF-BB)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TFG-β)等生長(zhǎng)因子。同時(shí), Shabbir A等[33]研究也證明了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(BMMSCs-Exos)具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移的作用，并且外泌體可以激活傷口愈合[蛋白激酶B(AKT)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT3)等]中的幾種重要信號(hào)通路，誘導(dǎo)干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、趨化因子基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)等多種生長(zhǎng)因子的表達(dá)。

Geiger等[34]提取人的循環(huán)纖維細(xì)胞，并用PDGF-BB 和TGF-β1刺激纖維細(xì)胞衍生外泌體。結(jié)果證實(shí)其具有促進(jìn)血管生成，誘導(dǎo)糖尿病皮膚成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和增殖，并加速2型糖尿病小鼠創(chuàng)面愈合的功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該外泌體中含有多種有效成分，如成血管相關(guān)的mir-126、mir-130a、mir-132, 抗炎相關(guān)的mir-124a、mir-125b, 以及調(diào)節(jié)膠原形成的miR-21, 進(jìn)一步從分子層面解釋了外泌體促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的機(jī)制。

2.2 促進(jìn)血管生成

血管生成是決定糖尿病性潰瘍愈合結(jié)果的關(guān)鍵因素[35], 具有極其重要的生理學(xué)作用。目前較多文獻(xiàn)證實(shí)了間充質(zhì)干細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞分泌的外泌體可以促進(jìn)血管的生成，從而加速糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的愈合。

Tao等[31]在糖尿病大鼠體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)mir-126-3p過度表達(dá)的SMSCs-Exos可促進(jìn)血管生成，加速再上皮化和體內(nèi)膠原成熟，表明了SMSC-126外泌體能夠加速糖尿病性潰瘍創(chuàng)面愈合。Guo等[32]發(fā)現(xiàn)PRP-Exos可能通過激活ERK和Akt信號(hào)通路參與誘導(dǎo)血管生成。Dalirfardouei等[36]發(fā)現(xiàn)經(jīng)血源性間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(MenSCs-Exos)可以通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A促進(jìn)新生血管的形成。Chen等[37]發(fā)現(xiàn)人尿源干細(xì)胞外泌體(USC-Exos)中富含一種叫做DMBT1的促血管生成蛋白，是促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成和創(chuàng)面愈合的必需物質(zhì)，故USC-Exos可以通過轉(zhuǎn)移DMBT1蛋白來促進(jìn)血管生成，加速潰瘍愈合。

內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在生理或病理因素刺激下，可從骨髓中動(dòng)員到外周血液參與血管損傷的修復(fù)。有研究[38-39]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮祖細(xì)胞來源的外泌體能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移能力，提高VEGF、人低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)等因子表達(dá)，加速糖尿病大鼠模型潰瘍創(chuàng)面的愈合。Zhang等[40]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞源性的外泌體可以影響在成血管中有重要作用的ERK1/2通路，調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)促進(jìn)糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的修復(fù)與再生。Li等[41]研究結(jié)果表明，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞源性的外泌體(ADSCs-Exos)能夠促進(jìn)EPCs的增殖和血管生成，促進(jìn)肉芽組織形成和生長(zhǎng)因子表達(dá)以及降低炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白水平，從而顯著減少糖尿病大鼠足部潰瘍面積。上述研究均表明來自間充質(zhì)干細(xì)胞源性的外泌體能夠調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能，促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面愈合。

2.3 調(diào)控炎性因子

在糖尿病患者中，潰瘍創(chuàng)面局部的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)等表達(dá)明顯升高，已有較多研究發(fā)現(xiàn)外泌體可以通過調(diào)節(jié)損傷局部的炎癥反應(yīng)來促進(jìn)皮膚的修復(fù)。

Li等[42]發(fā)現(xiàn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體(hucMSCs-Exos)在糖尿病大鼠燒傷模型中可以抑制炎癥反應(yīng)，降低TNF-α、IL-1β的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子IL-10的表達(dá)。外泌體所含的miR-181c過表達(dá)可以有效減少炎性因子分泌，抑制TLR-4信號(hào)通路，減少NF-κB/p65的通路激活，抑制炎癥反應(yīng)。有研究[36]也發(fā)現(xiàn)MenSCs-Exos通過NF-κB/p65亞單位上調(diào)和激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)M1-M2巨噬細(xì)胞極化來減輕炎癥。

Ti等[43]評(píng)估了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體(LPS pre-Exo)對(duì)糖尿病慢性炎癥和創(chuàng)面愈合的治療效果，發(fā)現(xiàn)其上調(diào)抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)和促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞活化，激活let-7b/TLR4通路，促進(jìn)慢性炎癥消退，加速糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合。因此，外泌體調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)可能是通過激活NF-κB/p65、let-7b/TLR4通路，降低炎性因子TNF-α、IL-1β等的表達(dá)和誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化來實(shí)現(xiàn)的。

2.4 對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變的影響

糖尿病性潰瘍創(chuàng)面與普通創(chuàng)面的另一區(qū)別在高糖環(huán)境會(huì)導(dǎo)致周圍神經(jīng)病變的發(fā)生，神經(jīng)傳導(dǎo)速度變慢，皮膚感覺減退，失去原有的保護(hù)作用，不利于創(chuàng)面的愈合。Jia等[44]發(fā)現(xiàn)在體外實(shí)驗(yàn)中，用高糖外泌體處理遠(yuǎn)端軸突后導(dǎo)致軸突生長(zhǎng)減少，這與軸突中miR-28、miR-31a和miR-130a的升高以及它們的靶蛋白DNA甲基轉(zhuǎn)移酶-3a、Numb、突觸體相關(guān)蛋白25和生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43的減少有關(guān)，而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示高糖外泌體作用于小鼠坐骨神經(jīng)可誘導(dǎo)周圍神經(jīng)病變的發(fā)生。這一結(jié)果提示了來源于高糖刺激的施旺細(xì)胞的外泌體在介導(dǎo)糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)展中起到了一定的作用。

另一方面，MSCs-Exos能夠介導(dǎo)受損神經(jīng)元組織的功能修復(fù)。有研究[45]發(fā)現(xiàn)MSCs可以通過傳遞外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)miR-133a以促進(jìn)軸突重塑和神經(jīng)元生長(zhǎng)，改善受損神經(jīng)元組織的功能。因此，外泌體作為細(xì)胞通訊的媒介，可以雙向調(diào)控糖尿病周圍神經(jīng)病變的發(fā)生、發(fā)展，提供了一種新的治療思路。

2.5 外泌體在糖尿病性潰瘍中的應(yīng)用

在最新的文獻(xiàn)報(bào)道中，有學(xué)者將外泌體與別的介質(zhì)相融合形成藥物材料，并將其應(yīng)用于糖尿病性潰瘍創(chuàng)面的損傷修復(fù)中，以評(píng)價(jià)其作用效果，開創(chuàng)了一種無細(xì)胞、無創(chuàng)的治療方案。

Wang C等[46]發(fā)明了一種FHE@exo復(fù)合水凝膠，是將AMSCs-exo搭載到FHE水凝膠上，具有加速愈合、剪切稀化、高效抗菌、不受pH影響且釋放具有生物活性的外泌體等多種功能，可協(xié)同促進(jìn)潰瘍愈合和皮膚再生。Xu N等[47]從莪術(shù)根莖中成功分離純化了一種均一多糖(ZWP), 并將其結(jié)合到負(fù)載富血小板血漿外泌體的殼聚糖/絲水凝膠海綿上形成PRP-Exos/ZWP。Shi Q等[48]分離來自牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(GMSCs)的外泌體，然后將其負(fù)載到殼聚糖/絲質(zhì)水凝膠海綿上，以評(píng)估這種新的非侵入性方法對(duì)糖尿病大鼠潰瘍的影響。上述2項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)外泌體復(fù)合物材料能夠通過促進(jìn)膠原的再上皮化、沉積和重塑，促進(jìn)血管生成和神經(jīng)元的內(nèi)向生長(zhǎng)，從而有效地促進(jìn)糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面愈合。以上這些發(fā)現(xiàn)為糖尿病性潰瘍修復(fù)提供了一種新的外泌體介導(dǎo)的臨床治療方法。

3 總結(jié)與展望

外泌體是一類納米級(jí)的細(xì)胞外囊泡，隨著對(duì)其生物特性和功能的深入研究，發(fā)現(xiàn)其可以介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，調(diào)控生理及病理活動(dòng)，并具有一定的治療價(jià)值。本研究總結(jié)了外泌體有助于糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制包括促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移、刺激血管生成，調(diào)控炎癥反應(yīng)、分泌生長(zhǎng)因子和加速膠原合成，以及改善糖尿病神經(jīng)病變等。故而提供了一種全新的治療糖尿病性潰瘍的思路，具有廣闊的前景。最新的研究方向顯示了外泌體還可以被設(shè)計(jì)為載體，運(yùn)載藥物或RNA進(jìn)入靶細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定位，用于靶向治療，開辟了修復(fù)糖尿病性潰瘍的一種無細(xì)胞、無創(chuàng)性的治療方法。

然而，目前將外泌體應(yīng)用于治療糖尿病性潰瘍?nèi)匀淮嬖谝恍﹩栴}，包括如何高效制備和分離高純度的外泌體，以及無法分離不同細(xì)胞釋放的特定外泌體。未來的研究應(yīng)著眼于開發(fā)更有效地分離提純方法，以解決上述這些問題。此外，外泌體促進(jìn)糖尿病性潰瘍愈合的具體機(jī)制以及如何將其更好地應(yīng)用于臨床中仍有待于進(jìn)一步探索。相信在不久的將來，研究者對(duì)外泌體會(huì)有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，并在治療糖尿病性潰瘍中得到越來越多的應(yīng)用。