MicroRNA在甲狀腺功能減退癥中的作用＊

趙 靜，柏力萄，李 菲，王丹瑋，吳芳瑩，董廣通，魏軍平

（中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院 北京 100053）

甲狀腺功能減退癥（hypothyroidism，簡稱甲減）是由于甲狀腺激素合成和分泌減少或組織作用減弱導致的全身代謝減低綜合征，主要分為臨床甲減（overt hypothyroidism）和 亞 臨 床 甲 減（subclinical hypothyroidism，SCH，簡稱亞甲減）。甲減是患病率僅次于甲狀腺結節(jié)的第二大類甲狀腺疾病，我國患病率為17.8%，其中臨床甲減與亞甲減的患病率分別為1.1%和16.7%[1,2]，但目前甲減分型繁多，病因較為復雜，相應病理機制在很大程度上仍未得到闡明。近年來，miRNA的發(fā)展為多種疾病的闡釋提供了嶄新的視角。越來越多研究表明，如miRNA與甲狀腺的生理功能，甲減的病因、病理、診斷、治療等方面均具有一定聯系。多種miRNA在甲狀腺功能減退癥中存在差異表達，并可能參與相應的病理進程?，F就miRNA在甲狀腺功能減退癥中的研究及應用進展進行綜述。

1 miRNA概述

微小RNA(microRNA miRNA)是一組內源性、功能性的非編碼小RNA，長度約18-24個核苷酸，可在轉錄后水平調控基因表達，影響下游蛋白的翻譯，進而參與細胞增殖、分化、凋亡、機體應激、免疫、生長和發(fā)育等多種生物學過程，并發(fā)揮重要調控作用[3]。miRNA可調控人類近1/3的信使RNA（messenger RNA，mRNA），而miRNA的表達改變可能導致多種病理狀態(tài)和臨床疾病包括腫瘤、神經系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等的發(fā)生發(fā)展。

成熟miRNA形成的經典過程一般包括如下步驟：第一步，miRNA基因主要被RNA聚合酶II（RNA polymerase II，POLⅡ）轉錄成長度為幾百到幾千個核苷酸且具有典型發(fā)夾結構的miRNA初級前體primiRNA。第二步，pri-miRNA在雙鏈的RNA核酸內切酶RNaseⅢ-Drosha、雙鏈RNA結合蛋白迪喬治綜合征危象區(qū)基因 8（Di George syndrome critical region8，DGCR8）作用下，被加工為大小約70個核苷酸并可形成莖-環(huán)結構的miRNA前體，即pre-miRNA，這一次剪切發(fā)生在細胞核內。第三步，pre-miRNA通過輸出蛋白5（exportin 5,XPO 5）從核內轉運到細胞質中，并被Dicer內切酶剪切加工為不完全配對的雙鏈RNA雙體miRNA/miRNA*，其中miRNA與RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex,RISC)結合，形成微小RNA基因沉默復合物（miRISC），miRISC可與特定靶mRNA 的 3′-非編碼區(qū)（3′-UTR）結合，從而降解mRNA或阻遏其翻譯，進而影響基因的轉錄后表達，而關鍵miRNA生物發(fā)生因子的遺傳改變可導致疾病[4,5]。

目前研究表明，miRNA與甲狀腺的生理功能，甲減的病因、發(fā)病機理、診斷、治療等均有一定關系，因此，深入了解miRNA在發(fā)育和疾病中的作用，有助于探明甲減的發(fā)病機制，并有望為未來針對甲減的miRNA靶向藥物如miRNA抑制劑的開發(fā)提供部分思路。

2 miRNA在甲狀腺生理功能中的作用

2.1 miRNA與甲狀腺發(fā)育

miRNA是一類小的非編碼RNA，在轉錄后水平調節(jié)基因表達，在機體的生長發(fā)育中發(fā)揮重要調控作用。Dicer酶作為miRNA成熟過程中的關鍵酶之一，對于闡明miRNA功能意義重大。迄今為止，已經在幾種條件性Dicer敲除的小鼠模型中證明了miRNA對于正常器官發(fā)生的重要性，相關研究證實其在甲狀腺的發(fā)育過程中也起到關鍵作用。一方面，miRNA通過調整甲狀腺特異性基因的表達，維持甲狀腺組織自穩(wěn)態(tài)。Rodriguez W等[6]發(fā)現Dicer突變小鼠可以發(fā)生嚴重甲狀腺功能減退并在斷奶后迅速死亡，并在Dicer突變小鼠甲狀腺中觀察到明顯的甲狀腺濾泡破壞以及鈉碘轉運體（Sodium/iodine symporter,NIS）表達的明顯下調，證實由于Dicer失活導致的miRNA成熟異?？蓢乐馗蓴_功能性甲狀腺分化。Undeutsch H等[7]設計了甲狀腺細胞特異性Dicer1基因敲除小鼠，發(fā)現甲狀腺細胞中Dicer1缺陷與甲狀旁腺纖維化，脂肪形成和Tgf-β信號傳導基因的增強表達均有關系。從而證實Dicer1是甲狀腺濾泡組織，甲狀腺細胞分化和甲狀腺腫大發(fā)展所必需的。Frezzetti D等[8]認為甲狀腺的發(fā)育和早期分化不受Dicer缺乏的影響，而嚴重的甲狀腺功能減退癥在出生后逐漸發(fā)展，導致體重減輕和壽命縮短。因此，完整的miRNA加工機制對于甲狀腺生理學至關重要，特定miRNA的失調也可能與人類甲狀腺功能障礙有關。另一方面，DGCR8蛋白是miRNA生物發(fā)生機制的重要組成部分，其缺失也導致嚴重的甲狀腺功能減退，動物體重迅速下降最終導致腎衰竭和動物死亡，進一步證實miRNA在甲狀腺器官穩(wěn)態(tài)中所發(fā)揮的重要功能[9]。

2.2 miRNA與甲狀腺激素（Thyroid hormone,TH）

甲狀腺是貯存及分泌TH的重要器官，TH廣泛存在于機體的各組織器官,調節(jié)糖類、脂肪、蛋白質的合成和分解代謝,并在機體生長發(fā)育、物質代謝及能量消耗等生理進程中發(fā)揮關鍵作用。骨骼肌是TH的重要靶組織之一，生理水平的TH可調節(jié)人體骨骼肌中的多個基因，左旋甲狀腺素（L-T4）治療可誘導骨骼肌中miR-206/miR-133b初級轉錄物的大量下調[10]。然而在針對血清中miRNA表達譜的研究中則未發(fā)現不同甲狀腺狀態(tài)下miRNA的表達存在顯著差異[11]。

3 miRNA在甲減發(fā)病中的作用

3.1 miRNA與自身免疫性甲狀腺炎

甲狀腺功能減退癥病因復雜，以原發(fā)性甲減多見，約占99%，其中自身免疫、甲狀腺手術、甲亢碘131治療三大原因則占90%以上，其他包括放射性碘或抗甲狀腺藥物的使用，以及與甲狀腺無關的藥物如胺碘酮，鋰和干擾素的不良反應等[12]。橋本甲狀腺炎（Hashimoto thyroiditis，HT）作為自身免疫性甲狀腺疾病中的最常見類型，是成人原發(fā)性甲減的重要原因[13]。研究表明，多種miRNA的異常表達與HT的發(fā)生、發(fā)展、預后之間存在密切聯系，如miR-142-5p被認為可能通過調控緊密連接蛋白-1(tight junction protein 1,CLDN1)從而影響HT發(fā)病，而miR-155則可通過影響Th1、Th17等CD4+T細胞亞群分化以及分泌炎癥性細胞因子參與HT的發(fā)生、發(fā)展。目前已有針對miRNA的靶向藥物處于臨床試驗階段，并取得了一定療效，未來有望將miRNA靶向治療劑應用于HT診療中，從而達到早期治療HT，防止自身免疫性炎癥過程中甲狀腺濾泡細胞的破壞及其向甲減的進一步轉化。

3.2 miRNA與先天性甲狀腺功能減退癥(congenital hypothyroidism,CH)

CH即出生時即診斷的甲狀腺激素缺乏癥，是引發(fā)嬰幼兒精神發(fā)育遲緩的最常見原因之一，因可臨床干預，故早期診斷及治療十分重要，部分miRNAs被認為在CH的神經系統(tǒng)發(fā)育中起到一定作用。Li W等[14]的研究表明miRNA-124-3p通過靶向程序性細胞死亡蛋白6（Programmed cell death 6,PDCD6）而在CH中發(fā)揮神經保護作用，并有望作為嬰兒CH的潛在治療靶標，這在一定程度上闡明了miR-124-3p在CH中的作用和分子機制。

4 miRNA與甲減相關并發(fā)癥

4.1 脂代謝紊亂

甲減是繼發(fā)性脂代謝紊亂的常見病因之一，?？梢娧蹇偰懝檀迹═otal cholesterol,TC）、低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C）、甘油三酯（triglyceride,TG）升高，從而增加心血管事件的發(fā)生及死亡率，其發(fā)生機制主要與甲狀腺激素水平下降有關[15]。一般認為，甲狀腺激素能夠上調肝臟細胞膜LDL-C受體mRNA表達及3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase,HMGR)活性、參與膽固醇分解代謝等，從而調節(jié)脂質穩(wěn)態(tài)，而甲狀腺激素不足則會導致相應的脂代謝紊亂。多個研究表明，miRNA的表達改變可能導致血脂水平異常，如miR-22是血脂異常的重要調節(jié)因子，并可能作為治療與肥胖相關的血脂異常的潛在候選miRNA[16]。miR-30c則可通過減少脂質生物合成和脂蛋白分泌，從而調節(jié)肝臟和血漿脂質濃度，而提高miR-30c水平可能有助于治療高脂血癥及其相關疾病[17]。

4.2 心臟病變

心臟是甲狀腺激素重要的靶器官,甲減常可影響心臟，而出現心肌收縮力減弱、心排血量降低、心臟擴大、心包積液等一系列癥狀體征，即甲減性心臟病，miRNA可從基因層面輔助闡釋其發(fā)生發(fā)展機制。張司蕾等[18]對甲減大鼠心肌中miRNA表達情況進行研究，發(fā)現miR-206表達升高，，胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)表達水平下降，而這種變化又可被L-T4所糾正，進而指出，甲減大鼠心肌miR-206可能通過對IGF-1蛋白的轉錄后抑制作用，參與甲減性心臟病變發(fā)生。

4.3 腦發(fā)育異常

妊娠期甲狀腺激素缺乏?？蓢乐赜绊懱捍竽X發(fā)育，多種miRNAs在甲減所致腦發(fā)育異常中也有差異表達。邢倩等[19]對甲減及正常Wistar母鼠后代腦組織的差異性表達miRNA譜進行分析，結果發(fā)現甲減胎/仔鼠腦組織中 mir-206、mir-324-5p、mir-34c、mir-204、mir-194、mir-146b、mir-532-5p、mir-384-5p、mir-215、mir-212增高2倍以上，而mir-200b、mir-200c、mir-217、mir-672、mir-139-5p、mir-376-3p、mir-672、mir-204、mir-335、mir-376-3p等表達則降低50%以上。研究組進一步研究發(fā)現[20]，miR-206可通過靶向BDNF的3'-UTR，從而參與妊娠早期甲狀腺功能減退癥母鼠后代的腦發(fā)育。神經干細胞（neural stem cells,NSCs）是甲狀腺激素的主要靶標，miR-125b-5p可能通過靶向調控Stat3從而影響NSCs分化，進而參與抑制甲減發(fā)展進程，,在一定程度上闡明了甲狀腺激素在大腦發(fā)育過程中的潛在機制[21]。又有研究表明，miR-124可抑制甲狀腺功能減退大鼠海馬神經元凋亡，從而保護甲減大鼠的神經細胞[22]。

5 亞臨床甲減（subclinical hypothyroidism,SCH)

5.1 SCH與脂代謝紊亂

SCH可導致血脂水平的變化，，并與動脈粥樣硬化（atherosclerosis，ATH)密切相關，miRNA則作為基因調節(jié)劑參與了SCH患者的ATH及血脂異常進程。張新煥等[23,24]將受試者分為正常組（n=22）、單純SCH組（n=20）、SCH伴ATH組（n=21）以及單純ATH無SCH（n=22）組，觀察6種與動脈硬化發(fā)生發(fā)展過程密切相關的血清 miRNA（miR-21-5p、miR-125a-5p、miR-126-3p、miR-210、miR-221-3p、miR-222-3p）的差異表達。結果表明，miR-21-5p在SCH以及SCH合并ATH患者中均存在特異性表達上調，miR-125a-5p，miR-126-3p，miR-221-3p和miR-222-3p的下調可能是SCH合并ATH或者單純ATH患者中動脈粥樣硬化的表現，而miR-126-3p則在所有ATH患者中均存在特異性表達。張立亞等[25]對小鼠SCH模型的肝臟miRNA表達譜進行研究，發(fā)現miR-10b-5p、miR-24-3p、miR-29a-3p、miR-30b-5p、miR-34a-5p、miR-125b-5p、miR-130a-5p和miR-199a-5p等表達量顯著下調，進一步通路分析表明，miR-34a-5p/Aldh3a2、miR-34a-5p/Txn、miR-130a-3p/Eef1b、miR-130a-3p/Psap以及miR-24-5p/Selenbp2等通路調控關系在SCH脂代謝紊亂的發(fā)病中起到一定作用。

5.2 SCH與冠心病

SCH在冠心病的發(fā)展中也起到關鍵作用，Quan X等[26]研究了冠心病患者中循環(huán)miRNA的表達情況，表明miR-146a水平與SCH患者的冠心病發(fā)病率及冠狀動脈粥樣硬化的嚴重程度相關，而血漿TSH水平與miR-146a水平正相關，循環(huán)miR-146a可能是SCH患者冠心病的潛在生物標志物。何雨峰等[27]同樣對循環(huán)miR-146a水平對SCH病人冠心病的預測價值進行了探討，結論認為miR-146a是SCH患者冠心病發(fā)病的獨立危險因素,血漿miR-146a水平對SCH患者冠心病發(fā)病具有一定的預測價值。

5.3 SCH與妊娠期流產

目前SCH已被證明與多種妊娠并發(fā)癥有關，包括自然流產（spontaneous abortion,SA），miRNA在一定程度上對其機制做出闡述。Zhou Y等[28]通過測定SCH，SCH與SA（SCH+SA）患者以及SA患者和健康對照（HC）患者的血清miRNA表達，指出miR-940或miR-486-5p可能是SCH患者SA早期診斷的潛在預測生物標志物，有助于臨床用于早期診斷及干預。

6 miRNA在中醫(yī)藥中的應用

MiRNA理論為中醫(yī)藥的發(fā)展提供了新的切入點，目前其在中醫(yī)藥中的運用主要體現在疾病的中醫(yī)辨證分型、發(fā)病機制及中藥藥效闡釋等方面，具體如血瘀證的辨證分型及診斷網絡的構建、乙型肝炎肝硬化中醫(yī)綜合征的發(fā)展評估、對川楝子誘導小鼠肝臟損傷的機制闡述及作為潛在的生物標志物評估中藥臨床療效的運用等方面。

6.1 miRNA與中醫(yī)辨證

證侯是對中醫(yī)學對疾病當前階段的病位、病性等所作的結論，體現著從分子、細胞到組織、器官、系統(tǒng)水平的綜合動態(tài)變化。而miRNA參與人體多種生物學過程，并具有特異性及時空性的特點，參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，miRNA及其表達的動態(tài)演變過程和與臨床上出現的癥狀、體征必然有內在聯系，并參與證侯的發(fā)生和動態(tài)演變[29]。目前已有研究表明，miRNA作為潛在的生物標志物，用于評估慢性乙型肝炎[30,31]、乙型肝炎肝硬化[32]、胰腺癌[33]等疾病中不同中醫(yī)證候的分類及演變趨勢，在一定程度上闡述了不同中醫(yī)證侯在這些疾病中的分子基礎。Liao J[34]等對血瘀證的研究則表明，miR-146b-5p，-199a-5p和23種靶向mRNA形成了血瘀證的診斷網絡，可能為血瘀證的診斷提供更客觀的應用標準。

6.2 miRNA與中醫(yī)體質

體質是人體受先天因素和后天因素的影響從而在形態(tài)和功能等方面所具備的固有相對穩(wěn)定的特性。中醫(yī)體質理論認為，體質在一定程度上決定了疾病的易感性及其發(fā)展方向，對體質的準確辨識可以幫助臨床醫(yī)生進行臨床決策。miRNA與體質也有一定關系。體質不同的人可能具有不同的miRNA表達譜。有研究[35]表明，陽虛質與陰虛質擁有不同的miRNA表達譜，甲狀腺激素信號傳導途徑在兩種體質中均存在，這些調節(jié)甲狀腺激素信號通路的miRNA可能與陽虛質的冷不耐受與陰虛質的熱不耐受有關。因此，有望通過miRNA差異表達進一步闡述中醫(yī)體質的不同特征，從而為體質的微觀辨別提供思路。

6.3 miRNA與中藥作用機制

miRNA在轉錄后水平對基因進行調控，被證實與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展相關，而外源性來自中藥的miRNA可吸收入體內穩(wěn)定存在，并調節(jié)哺乳動物基因表達，為從miRNA角度闡釋中藥調控機制提供思路，并有潛力作為口服的基因靶向治療劑進行研究[36,37]。多個研究已經表明，中藥可以通過調控miRNA及其相應通路，進而在疾病治療中發(fā)揮作用。如中藥復方和氣散可能通過影響miRNA-144-3p及相應信號通路，改變血清激素水平、恢復病變卵巢形態(tài)、改善胰島素抵抗等從而改善多囊卵巢綜合征[38]。滋陰和清火中藥復合制劑可通過調控下丘腦Lin28/let7途徑在性早熟模型大鼠中起到一定作用[39]。中藥瀉肺利水方可通過下調心肌中miR-25-3p和miR-25-5p的表達，上調心肌肌漿網Ca2+-ATP酶2a（sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase2a,SERCA2a）心肌mRNA表達，改善在心力衰竭大鼠的心功能[40]。

6.4 miRNA與中藥肝毒性

中藥的肝毒性是中藥使用中不可忽視的臨床問題，多種中藥都被報道肝毒性，如何首烏、黃藥子、川楝子等，然而因為中藥成分復雜，其引起肝毒性的毒理學機制很大程度上未被闡明。黃藥子作為癭病常用中藥，具有散結的作用，常用與甲狀腺結節(jié)等的中醫(yī)診療之中。但是其肝毒性不可忽視，miRNA在闡述其肝毒性發(fā)生機制方面也取得了一定進展。楊睿等基于miRNA進行黃藥子肝毒性生物標志物的篩選及毒性機制的探索研究表明，miR-5099可以作為黃藥子誘導急性肝毒性的特異性血清生物標志物。而miR-200a-3p，miR-5132-5p和miR-5130及其控的質網蛋白應激通路，以及靶基因Dnaja1可能在黃藥子乙酸乙酯提取物誘導的急性肝毒性中發(fā)揮了重要的調控作用[41]。盛云華等對黃藥子及山豆根所致的肝損傷進行研究，認為miR-23和miR-142-5p可作為黃藥子致肝損傷早期敏感指標之一[42]。川楝子味苦有小毒，有疏肝行氣、止痛、驅蟲等功效，臨床常用于癭病的治療之中，其肝毒性同樣引起臨床廣泛關注。部分研究對miRNA在川楝子引起肝毒性的機制進行了探討，Zheng J等[43]通過對川楝子誘導的肝損傷小鼠肝臟樣品mRNA和microRNA表達譜進行分析，指出經川楝子提取物處理后8種miRNA和1,723種mRNA有顯著改變。對于8個差異表達的miRNA，收集了它們預測的靶基因，并選擇了最終的125個基因和4個miRNA（miR-139-5p，miR-199a-5p，miR-2861和miR-3960）進行研究，結果表明，川楝子提取物引起了小鼠細胞生長和增殖，基因表達和細胞發(fā)育等多方面的細胞功能紊亂，推測氧化應激反應引起的肝細胞壞死是川楝子提取物的主要肝臟毒性。研究人員在隨后的實驗進一步中指出[44]，血清miR-370-3p可能通過升高p21蛋白和細胞周期蛋白E(cell cycle protein E,cyclin E)加劇細胞毒作用，產生肝毒性，從而揭示了川楝子誘導小鼠肝臟損傷的機制。miRNA在甲減中醫(yī)藥治療中的應用目前尚未見文獻報道，未來有待進一步深入研究。

綜上所述，miRNA在甲狀腺的生理功能以及甲減的發(fā)病、并發(fā)癥等進程中發(fā)揮重要作用，有望作為疾病治療的靶點應用于臨床中。此外，miRNA在中醫(yī)藥中的應用也取得了一定進展，未來有待進一步將甲減不同證型及正常對照人群進行miRNA的基因表達譜分析，篩選甲減各證型的差異基因，從基因層面對甲減的證型本質和病理機制進行探索，并試圖闡釋甲減不同中醫(yī)證候形成的生物學基礎及發(fā)生機理，為未來完善甲減不同證型的生物標志物及靶點干預提供客觀科學依據。