基于Cancer Browser數(shù)據(jù)庫分析促癌基因HMGA2在腎癌中的表達及其臨床意義

劉 偉,寇 博

(1西安交通大學醫(yī)學部第一附屬醫(yī)院血管外科,西安 710061;2西安交通大學醫(yī)學部第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科;*通訊作者,E-mail:492526094@qq.com)

腎細胞癌在人類所有腫瘤中占2%-3%,而在西方國家中是第九大最為常見的惡性腫瘤[1]。過去的20多年里,腎癌的發(fā)病率呈2%的增長[2]。盡管新的治療手段在不斷地提高腎癌患者的生存期,但多數(shù)患者最終會進展為抵抗型腎細胞癌。因此,探尋有效的診斷性分子標志物以及治療靶點顯得極為重要。

高遷移率族蛋白A2(HMGA2)屬于高遷移率族蛋白家族中的一員,是一種非組蛋白染色質蛋白。研究發(fā)現(xiàn)HMGA2在正常組織中少有表達,但在喉癌、肺癌等多種腫瘤中呈高表達[3,4]。文獻報道,HMGA2可參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化、上皮間質轉化等多種生物學行為[5-7]。而上皮間質轉化是腫瘤侵襲轉移的特征之一,是多個信號通路參與調控,使上皮細胞特性喪失并獲得間充質細胞特性的復雜過程。本研究基于Cancer Browser數(shù)據(jù)庫分析HMGA2在腎癌中的表達及其與上皮間質轉化指標的關系,進而為闡明HMGA2在腎癌進程中的作用提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫分析

本研究通過檢索Cancer Browser數(shù)據(jù)庫,檢索“renal cell carcinoma”,提取有關腎癌的臨床數(shù)據(jù)及基因表達(TCGA-KIRC-exp-HiSeqV2-2015-02-24),檢索關鍵詞“HMGA2”,提取HMGA2在腎癌中表達的數(shù)據(jù),并通過GraphPad 6.0軟件分析HMGA2與腎癌的TNM、Stage分期之間的關系。

1.2 臨床資料

選取了2019年3月住院的兩名腎癌患者,兩位患者年齡分別為53歲和58歲,術前檢查未合并其他實質臟器腫瘤或感染性疾病,兩名患者入院后均行后腹腔鏡下腎癌根治術,術后病理檢查提示為腎癌。取部分腎癌組織及癌旁正常組織各一塊,儲存于-80 ℃?zhèn)溆?。所有材料的取用均?jīng)患者及家屬知情同意,并簽署相關知情同意書。

1.3 細胞培養(yǎng)和主要試劑

人腎小管上皮細胞HK2、胚胎腎293T細胞、腎癌786-O、769-P、SW839細胞系為西安交通大學第一附屬醫(yī)院轉化醫(yī)學中心實驗室所有,1640-DF12培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司,單克隆抗體HMGA2、Twist1、Twist2、Zeb1、Zeb2和β-actin購自美國Abcam公司,TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司,PCR引物、RNA反轉錄試劑盒購自日本Takara公司。

腎小管上皮細胞和腎癌細胞均用含10%胎牛血清的1640-DF12培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)基內含青霉素(100 U/ml)及鏈霉素(100 U/ml),常規(guī)在37 ℃、含5% CO2的細胞孵育箱內培養(yǎng)。細胞每隔2-3 d換液、傳代。

1.4 Western blot檢測EMT相關蛋白及HMGA2蛋白的表達

腫瘤組織或細胞經(jīng)PBS緩沖液清洗后,用RIPA裂解液裂解組織或細胞。充分裂解離心后提取上清液,并進行蛋白定量。隨后取20 μg變性蛋白樣品作聚丙烯酰胺凝膠電泳,經(jīng)轉膜和脫脂奶粉封閉后,分別加入HMGA2、Twist1、Twist2、Zeb1、Zeb2、β-actin蛋白一抗(稀釋比例均為1 ∶1 000),4 ℃孵育過夜。經(jīng)TBST液洗脫后,室溫下孵育二抗(稀釋比例1 ∶1 000)。再次TBST液洗脫后,顯影液(美國Bio-Rad公司)顯影,利用Image Lab成像軟件(美國Bio-Rad公司)進行分析。

1.5 實時定量PCR檢測HMGA2的mRNA水平

腫瘤組織或者細胞通過TRIzol法提取總RNA,經(jīng)RNA定量后利用Takara反轉錄試劑盒合成cDNA。PCR擴增所需引物自行設計后,由日本Takara公司合成。引物序列為HMGA2正義5′-ACCCAGGGGAAGACCCAAA-3′,反義5′-CCTCTTGGCCGTTTTTCTCCA-3′;β-actin正義5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′,反義5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。隨后進行PCR擴增,通過BioRad CFXManager軟件定量分析。

1.6 采用質粒轉染敲低靶基因

取兩個無酶EP管,分別加入100 μl無血清培養(yǎng)基,然后1個EP管內加入2 μg敲低HMGA2質粒,另1個EP管內加入8 μl X-tremeGENE DNA轉染試劑,充分混勻后靜置5 min,再將兩個EP管內混液混勻后靜置15 min,然后將混液加至含293T細胞的6孔板內,將上述293T細胞在細胞孵育箱內培養(yǎng)48 h,隨后提取蛋白為后續(xù)的Western blot實驗做前期準備。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 Cancer Browser數(shù)據(jù)庫分析結果

通過Cancer Browser數(shù)據(jù)庫檢索分析,發(fā)現(xiàn)隨著腎癌的T、N、M分期的逐漸增高,HMGA2的表達亦顯著增高,且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01,見圖1);隨后進一步發(fā)現(xiàn)HMGA2的表達與腎癌的Stage分期也呈正相關關系,兩者的差異有統(tǒng)計學意義(見圖1)。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1圖1 Cancer Browser數(shù)據(jù)庫檢索分析HMGA2表達與腎癌的TNM、Stage分期之間的關系Figure 1 Relationship between the expression of HMGA2 and TNM, stage classification of renal cell carcinoma by Cancer Browser database

2.2 HMGA2在腎癌組織及細胞內的表達

Western blot結果顯示HMGA2在腎癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織,且實時定量PCR顯示腎癌組織中HMGA2的mRNA水平亦顯著高于癌旁正常組織(見圖2)。隨后進一步通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)在多種腎癌細胞內HMGA2的表達顯著高于其在正常腎小管上皮細胞HK2內的表達,且實時定量PCR的結果與之一致(見圖2)。這說明HMGA2在腎癌中呈高表達。

圖2 HMGA2在腎癌組織及細胞內的蛋白和mRNA表達Figure 2 The protein and mRNA levels of HMGA2 in the renal cell carcinoma tissues and cell lines

2.3 HMGA2與EMT指標的相關性

通過Cancer Browser數(shù)據(jù)庫檢索分析,我們前期發(fā)現(xiàn)HMGA2與Twist1、Twist2呈正相關關系[8]。本研究中分析發(fā)現(xiàn)HMGA2與Zeb1、Zeb2的表達之間無明顯的相關性(見圖3)。通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)在腎癌患者的腫瘤組織中Twist1、Twist2和HMGA2均呈高表達,而Zeb1和Zeb2的表達無明顯變化(見圖3)。而相較于正常腎小管上皮細胞HK2,腎癌細胞786-O內Twist1、Twist2和HMGA2均呈高表達,而Zeb1和Zeb2亦無顯著改變(見圖3)。

圖3 HMGA2與上皮間質轉化相關指標在腎癌中的相關性Figure 3 Correlations between HMGA2 and EMT-related markers in the renal cell carcinoma

2.4 HMGA2對腎癌細胞內EMT指標的影響

通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)敲低HMGA2可在腎癌細胞內抑制Twist1和Twist2的蛋白表達(見圖4);隨后的實時定量PCR結果亦證實HMGA2的敲低可下調Twist1和Twist2的mRNA表達(見圖4)。

圖4 敲低HMGA2對腎癌細胞786-O內Twist1和Twist2的影響Figure 4 Effect of HMGA2 knockdown on Twist1 and Twist2 of human renal cell carcinoma 786-O cells

3 討論

HMGA2作為一種轉錄因子,其自身不具備轉錄活性,但其包含有3個AT-hook結構,能夠結合于DNA上的AT序列富集區(qū)域,進而調控相關靶基因的表達。HMGA2在成人的正常組織中少有表達,而在腫瘤組織中呈高表達,且影響腫瘤的進展。研究發(fā)現(xiàn)HMGA2可促進乳腺癌的惡性進程[9]。也有文獻報道,HMGA2在神經(jīng)膠質瘤中可促進其侵襲及不良預后[10]。這說明HMGA2在腫瘤中扮演著促癌基因的角色。本研究通過Cancer Browser數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)HMGA2的表達與腎癌的TNM分期、Stage分期呈正相關關系,且兩者的差異有統(tǒng)計學意義。這提示HMGA2在腎癌的進程中起著重要作用。

而研究顯示,在腎癌ACHN細胞內,HMGA2的敲低可抑制其增殖和侵襲能力[11]。且Na等[12]學者發(fā)現(xiàn)HMGA2的高表達常常提示腎透明細胞癌的不良預后。為了進一步明確HMGA2在腎癌中的表達,通過Western blot和實時定量PCR發(fā)現(xiàn)HMGA2在腎癌組織及細胞內的表達顯著高于癌旁正常組織及正常腎小管上皮細胞。這提示HMGA2在腎癌中可能是一個促癌基因。而新近研究報道HMGA2與腫瘤的侵襲遷移、上皮間質轉化有著緊密關聯(lián)[13]。Sun等[14]學者發(fā)現(xiàn)HMGA2可通過調控Twist1促進胃癌的侵襲進程。也有學者發(fā)現(xiàn)沉默HMGA2可抑制前列腺癌的侵襲遷移能力[15]。而新近研究報道HMGA2可以通過調控TGF-β/Smad2信號通路促進腎癌細胞的上皮間質轉化過程[15]。本研究則通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)不管在腎癌組織還是在腎癌細胞內,HMGA2與Twist1、Twist2均呈高表達,而Zeb1和Zeb2的表達無明顯變化。這說明HMGA2與腎癌的侵襲轉移尤其是上皮間質轉化指標Twist1、Twist2關系密切。隨后我們進一步通過敲低HMGA2發(fā)現(xiàn)腎癌細胞內Twist1和Twist2的表達水平明顯下調。這提示HMGA2可在腎癌細胞內正向調控Twist1和Twist2的表達。研究發(fā)現(xiàn)在胃癌細胞內HMGA2可通過靶向作用于Twist1進而調控上皮間質轉化過程,因此HMGA2在腎癌細胞中如何調控Twist1和Twist2是后續(xù)研究的重點[7]。

總而言之,基于Cancer Browser數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)HMGA2與腎癌的TNM分期、Stage分期呈正相關。而通過一系列細胞生化實驗發(fā)現(xiàn),HMGA2在腎癌組織及細胞內呈高表達,且HMGA2可正向調控Twist1和Twist2的表達。