玉米苞葉中蘆丁的含量測(cè)定

1.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；3.廣西衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530023

玉米苞葉(corn husks)，是禾本科玉蜀黍?qū)僦参镉衩?Zea mays L)[1]果穗外部的包被部分。玉米苞葉含有大量的纖維素、一定量的淀粉、總黃酮及單糖多糖等活性成分。2017年我國(guó)玉米產(chǎn)量為21 589萬(wàn)噸，其中玉米副產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá)到百萬(wàn)噸級(jí)，大多數(shù)的玉米苞葉被丟棄或當(dāng)燃料使用，造成資源浪費(fèi)與環(huán)境污染，近年來對(duì)玉米苞葉的研究表明其具有降低血脂[2-5]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[6-7]、抗氧化[8]、抑制α-糖苷酶活性而降糖等藥理作用[9]。玉米苞葉可食可藥，渴望能開發(fā)成為防治心血管疾病的保健品或藥品。

目前還沒有關(guān)于玉米苞葉的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為此，筆者建立HPLC法測(cè)定玉米苞葉中蘆丁含量的方法，為玉米苞葉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)，為玉米苞葉的進(jìn)一步開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥材 玉米苞葉采自廣西各地，經(jīng)廣西一心藥業(yè)馬利飛副主任藥師鑒定均為禾本科玉蜀黍?qū)僦参镉衩?Zeamays L)的苞葉，來源見表1。

表1 10批不同產(chǎn)地的玉米藥材

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑 超聲波清洗器(昆山市超聲儀有限公司)；電子天平分析天平(瑞士梅特勒AJ150)；恒溫水浴鍋B-220(上海亞榮生化儀器廠)；高效液相色譜儀(Alliance e2695,美國(guó)沃特世)；蘆丁(批號(hào)：0787-200102，供含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；甲醇(廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心，分析純)；超純水。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：phenomenon C18 (5μm，250 mm×4.6 mm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流動(dòng)相：乙腈-0.1%冰醋酸(20∶80)；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品適量,置50 mL容量瓶中, 用甲醇溶解, 并至刻度, 搖勻, 得0.11 mg/mL的蘆丁對(duì)照溶液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，濾液備用。

1.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取經(jīng)干燥粉碎后的玉米苞葉粉末約0.5g(過100目篩)，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL,稱定重量，超聲提取30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2 方法學(xué)考察

2.1 線性關(guān)系考察 分別取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液2、5、10、15、20 μL注入高效液相色譜儀, 按上述色譜條件測(cè)定其峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并計(jì)算回歸方程：y=17559x+3478.8,r2=0.9996。表明蘆丁在0.1947～2.0047 μg·mL-1內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。進(jìn)樣量、峰面積見表2，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，對(duì)照品圖見圖2、樣品圖見圖3。

表2 蘆丁線性關(guān)系

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 蘆丁對(duì)照品

圖3 玉米苞葉樣品

2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液10 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果蘆丁峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.11%，結(jié)果表明儀器精密度良好，見表3。

表3 蘆丁精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 同一玉米6份,每份約0.5 g，精密稱定, 按1.3.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備, 進(jìn)樣量10 μL，RSD為1.01%(n=6)，結(jié)果表明樣品重復(fù)性良好，結(jié)果見表4。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一份供試品溶液, 在相同色譜條件下分別在 0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣10 μL，采用HPLC測(cè)定蘆丁的峰面積。在12 h內(nèi)蘆丁的RSD為1.41% (n=6)。結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表5。

2.5 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取同一批已測(cè)含量的供試品6份, 每份約0.5 g,精密稱定, 置具塞錐形瓶中, 分別精密加入適量的對(duì)照品，再加入甲醇20 mL,按上述供試品溶液的提取方法制備, 進(jìn)樣10 μL依法測(cè)定, 計(jì)算平均加樣回收率為97.7%，RSD為1.46%(n=6), 結(jié)果表明該方法可靠, 準(zhǔn)確度高，結(jié)果見表6。

表4 玉米苞葉的重復(fù)性試驗(yàn)

表5 玉米穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 玉米苞葉加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 玉米苞葉中蘆丁的含量測(cè)定

分別稱取10個(gè)產(chǎn)地玉米苞葉藥材粗粉, 按1.3.3項(xiàng)下供試品制備方法制備,精密吸取供試品溶液10 μL進(jìn)樣, 按1.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖,以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算各樣品中蘆丁的百分含量，結(jié)果見表7，結(jié)果表明廣西10個(gè)產(chǎn)地玉米苞葉的蘆丁含量相差不大。

表7 蘆丁的含量測(cè)定

4 小結(jié)

4.1 色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)分別考察了ThermoC18(5 μm，250 mm×4.6 mm)色譜柱，Agilent Wonda SilC18-WR(5 μm，250 mm×4.6 mm)色譜柱和phenomenon C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)色譜柱。結(jié)果顯示phenomenonC18(5 μm，250 mm×4.6 nm)色譜柱分離效果比較好。

本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水系統(tǒng)，甲醇-0.1%冰乙酸系統(tǒng)，乙腈-水系統(tǒng)，乙腈-0.1%冰醋酸系統(tǒng)，結(jié)果顯示乙腈-0.1%冰醋酸系統(tǒng)作為流動(dòng)相條件下峰形整體比較好，經(jīng)過幾種比例的考察，選用(20∶80)的比例最佳，所以選用乙腈-0.1%冰醋酸(20∶80)為流動(dòng)相。

本實(shí)驗(yàn)使用了二極管陣列檢測(cè)器(DAD檢測(cè)器)，對(duì)樣品進(jìn)行190～400 nm全波長(zhǎng)掃描，綜合考慮對(duì)照品的出峰情況及分離度，最終確定280 nm為本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

本實(shí)驗(yàn)分別考察了20 ℃、25 ℃和30 ℃ 3個(gè)不同柱溫的色譜圖，結(jié)果顯示25 ℃峰形整體比較好，所以選擇25 ℃為檢測(cè)溫度。

本實(shí)驗(yàn)分別考察0.5 mL/min流速、0.8 mL/min和1.0 mL/min的色譜圖，結(jié)果顯示0.8 mL/min流速色譜圖分離效果最佳，所以選擇流速為0.8 mL/min。

4.2 結(jié)果 試驗(yàn)建立HPLC測(cè)定玉米苞葉中蘆丁含量的方法，以甲醇為提取溶劑，超聲輔助提取玉米苞葉，提取液過0.22 μm微孔濾膜，利用HPLC測(cè)定。以色譜柱：phenomenonC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：0.8 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈-0.1%冰醋酸(20∶80)的條件分離較好。蘆丁進(jìn)樣量在0.19470～2.0047 μg·mL-1(r=0.9996)范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率為97.7%，RSD為0.93%(n=6)。該方法簡(jiǎn)便、快捷，重現(xiàn)性好，為玉米苞葉的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供依據(jù)。