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    響應(yīng)曲面分析法優(yōu)化常用水解酶熒光測試法研究

    2019-02-10 06:48:14賈淑嫻康曉慧郭劍芬劉捷豹
    關(guān)鍵詞:水解酶靜置底物

    賈淑嫻,康曉慧,郭劍芬,劉捷豹*

    (福建師范大學(xué) a.地理科學(xué)學(xué)院,b.濕潤亞熱帶山地生態(tài)國家重點(diǎn)實(shí)驗室培育基地,福州 350007)

    0 引言

    土壤酶是土壤中最活躍的有機(jī)成分之一,主要來源于土壤微生物分泌、植物根系分泌等。大部分酶是具有高催化活性的蛋白質(zhì)[1-3],其活性直接反映微生物的營養(yǎng)需求和土壤中碳、氮、磷營養(yǎng)要素分解的方向和強(qiáng)度[4, 5],以及土壤生態(tài)系統(tǒng)的變化。因此了解土壤酶活性對認(rèn)識微生物的功能及土壤生化循環(huán)具有重要的意義[6-7]。土壤酶受到礦物膠體和腐殖質(zhì)的強(qiáng)烈吸附作用,目前很難被提取出來并直接測定。當(dāng)前用于測定土壤水解酶活性的實(shí)驗原理有兩種,一是根據(jù)一定量底物在酶催化反應(yīng)過程中的生成物或剩余底物量間接測得的,二是測定單位時間內(nèi)酶催化的化學(xué)反應(yīng)量。常用測定土壤酶活性的具體方法有4種:分光光度法、熒光分析法、同位素測定法和電化學(xué)方法[8-10]。20世紀(jì)50年代至今,經(jīng)過多年的發(fā)展,土壤酶活性熒光測定法得到了認(rèn)可,在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的微孔板熒光測定法因為靈敏、便捷而得到了廣泛的應(yīng)用[11]。但是,傳統(tǒng)滴定方法測量的土壤酶活性和熒光法得到的結(jié)果之間無法直接對比,并且土壤的異質(zhì)性以及取樣后的不確定性可能會導(dǎo)致土壤酶活性的測試結(jié)果出現(xiàn)不確定性,比如Junichiro等[12]研究發(fā)現(xiàn),干燥和冷藏對β-葡糖苷酶活性影響顯著,而German等[13]綜述了土壤酶測定過程中的注意要點(diǎn)等。因此,使用熒光法測量土壤酶活性需提上議程,并且如何快速、準(zhǔn)確地測定酶活性成為重要的生態(tài)學(xué)問題。由于土壤團(tuán)聚中有機(jī)膠體與黏粒的相互復(fù)合是一個復(fù)雜的物理化學(xué)過程,而且各實(shí)驗室的設(shè)備各有特色,所以酶活性測定實(shí)驗的前處理手段并不統(tǒng)一。國際上采用高速破壁機(jī)來破壞土壤團(tuán)聚體[11,14],但高速剪切可能會使土壤蛋白質(zhì)變性;目前越來越多的實(shí)驗開始采用低功率超聲波破碎法來進(jìn)行預(yù)處理[15]。該方法的優(yōu)點(diǎn)是能夠使土壤團(tuán)聚體充分崩解、促進(jìn)樣品均質(zhì)化,提高酶活性測試的效率。但是每臺超聲破碎機(jī)一次只能處理一個樣品,如果沒有合理安排樣品處理時間和順序的話,這種方法可能會人為地導(dǎo)致實(shí)驗誤差變大。此外,采用Saiya-cork試驗方法的文章[14],樣品在添加底物后的培育時間一般為4 h,但也有方法采用了2 h[15]和1h[16]的培育時間。可見培育時間對于結(jié)果的影響可能較大,也是影響實(shí)驗結(jié)果的一個重要因素。在測定土壤酶活性時,國際上一般用懸浮液,但是澄清液對實(shí)驗結(jié)果的影響未見報道。因此有必要對影響土壤酶活性的幾個因素進(jìn)行綜合研究探討,為準(zhǔn)確測定酶活性提供實(shí)驗依據(jù)。國際上常測定的4種水解酶包括β-葡糖苷酶(βG)和纖維素二糖水解酶(CBH)(C需求)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG, N需求)和酸性磷酸酶(AP, P需求)[17]。響應(yīng)面法(Response Surface Methodology,RSM)是一種綜合實(shí)驗設(shè)計和數(shù)學(xué)建模的優(yōu)化方法,其具有實(shí)驗次數(shù)少、周期短、精密度高、求得回歸方程精度高、預(yù)測性能好,支持多種因素間交互作用分析等優(yōu)點(diǎn)[18-19],目前已在眾多實(shí)驗優(yōu)化設(shè)計中得到應(yīng)用。因此,本實(shí)驗以這4種水解酶為研究對象,通過設(shè)定3個因素,即高速磁力攪拌法替代超聲波破碎法對土壤樣品進(jìn)行不同攪拌時間的前處理、不同的培育時間、不同狀態(tài)的懸浮液,采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化土壤中4種常用水解酶活性的熒光測定法,研究森林土壤酶測定的最優(yōu)方式,以期能找到一種方便快捷的樣品處理方式,提高酶活性熒光測定法的效率,為森林土壤酶活性研究提供技術(shù)參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗地概況與土樣采集

    試驗地位于福建省西北部順昌縣的武坊林場(117°29′~118°14′E,26°38′~27°12′N)。該地屬亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候,多年平均降水量為1 600~1 800 mm,多年平均氣溫為18.5 ℃。土壤類型屬于紅壤。在該試驗地的天然常綠闊葉林和杉木人工林內(nèi)各設(shè)3塊20 m × 20 m樣方,其中常綠闊葉林樣地編號為N1、N2和N3,杉木林樣地編號為P1、P2和P3。天然常綠闊葉林海拔為200~290 m,優(yōu)勢種為殼斗科、樟科、山茶科、木蘭科等樹種,群落外貌多為常綠,一般呈暗綠色,林相整齊,樹冠多不連續(xù);杉木人工林海拔高度約為240~250 m,優(yōu)勢種為杉木,群落外貌整齊,呈深綠或灰綠色,植株分布均勻,高度一致。在每個樣方內(nèi)采用5點(diǎn)取樣法,用土鉆采集0~10 cm礦質(zhì)土壤,混合均勻,用無菌塑封袋密封后存于低溫保鮮箱中并運(yùn)回實(shí)驗室。

    1.2 數(shù)據(jù)來源

    表 1 因素水平Table 1 Experimental design of response surface analysis

    水平因素A 攪拌時間/minB 靜置時間/minC 培育時間/h-11003020154130305

    表 2 4種土壤水解酶及其常用底物Table 2 Four kinds of soil hydrolase and their common substrates

    酶類型縮寫詞酶編碼EC底物底物濃度酸性磷酸酶AP3.1.3.24-MUB-phosphate400 μmol·L-1纖維二糖水解酶CBH3.2.1.914-MUB-β-D-cellobioside400 μmol·L-1β-葡糖苷酶βG3.2.1.214-MUB-β-D-glucoside400 μmol·L-1β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶NAG3.1.6.14-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide400 μmol·L-1

    根據(jù)DeForest等、Sinsabaugh等人的研究結(jié)果[20-21]在前期單因素實(shí)驗的基礎(chǔ)上,試驗探究3種因素,即攪拌時間、靜置時間和樣品培育時間對酶活性結(jié)果的影響。根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗設(shè)計,進(jìn)行三因素三水平的實(shí)驗設(shè)計,測定酶活性的變化。根據(jù)軟件Design-Expert 8.0.6設(shè)計確定實(shí)驗方案,獲得土壤水解酶熒光法測試的最優(yōu)處理(表1、2)。本研究涉及4種常見水解酶及底物(表2),采用Synergy H4多功能酶標(biāo)儀測定水解酶的活性。

    1.3 實(shí)驗方法

    在酶活性測定前,將土樣混勻后過2 mm篩,置于4 ℃冰箱中冷藏保存。參照Saiya-Cork[13]和Sinsabaugh[21]的研究方法測定4種常見水解酶的活性。先取0.8 g過篩鮮土加入到150 mL 50 mM的醋酸緩沖液(pH=5.0)中,根據(jù)實(shí)驗設(shè)計,用磁力攪拌機(jī)連續(xù)攪拌(時間設(shè)置為3個梯度),使其均質(zhì)化,然后靜置(時間設(shè)置為3個梯度)后,用移液器取其上清液(或懸浮液)200 μL移入96微孔板,每個樣品有8個重復(fù)(200 μL樣品+50 μL底物),每次檢驗都以8個陰性對照(200 μL醋酸緩沖液+50 μL底物)、8個空白(200 μL樣品+50 μL醋酸緩沖液)和8個淬火標(biāo)準(zhǔn)液(200 μL醋酸緩沖液+50 μL標(biāo)準(zhǔn)液)為對照和校正。加完所有樣品后,將微孔板蓋上蓋置于20 ℃培養(yǎng)箱中,黑暗培育(時間設(shè)置為3個梯度)。最后取出微孔板,迅速在每個微孔加入10 μL NaOH (1.0 mM)使反應(yīng)停止。在反應(yīng)停止的1 min內(nèi),在多功能酶標(biāo)儀中檢測樣品熒光度(在365 nm下激發(fā),450 nm下檢測熒光值)。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    使用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析,使用Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖,通過Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計及優(yōu)化。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 攪拌時間和培育時間對土壤水解酶活性的影響

    在不同的攪拌時間下,AP酶活性隨著培育時間而發(fā)生波動(圖1a)。樣品經(jīng)過攪拌20 min和30 min后,在不同的培育時間梯度上AP酶活性波動較大,而經(jīng)過10 min攪拌前處理的酶活性在時間梯度上波動變化較前二者穩(wěn)定。培育時間在6 h以內(nèi),攪拌10 min時測得AP酶活性最高,且攪拌30 min,培育時間4 h,AP酶活性接近最大值,為2 499 nmol·h-1·g-1,超過4 h后酶活性下降;AP酶活性在攪拌20 min,培育時間3.5 h時達(dá)到最大值,為2 117 nmol·h-1·g-1,而后隨著培育時間增加,酶活性曲線呈現(xiàn)下降趨勢。此外,AP酶活性在培育時間為5.5 h,攪拌時間為20、30 min時達(dá)到最低值(圖1a)。

    在培育4 h時,攪拌10、30 min時CBH酶活性達(dá)到最大值,分別為67和48 nmol·h-1·g-1。而在攪拌時間20 min,培育時間為3 h時CBH酶活性達(dá)到最大值46 nmol·h-1·g-1。此外,培育時間在3.5~5 h時,攪拌時間為10 min時CBH酶活性高于其他攪拌時間(圖1b)。

    攪拌時間和培育時間對βG酶活性影響的3條曲線雖然波動性很大,但是整體呈上升趨勢(圖1c),且在培育4 h,攪拌時間為10、20 min時檢測到βG酶活性出現(xiàn)第一個峰值,分別為169、238 nmol·h-1·g-1,雖然由于曲線波動過大,不易找到各培育時間段中最適合的攪拌時間,但可以看出當(dāng)攪拌時間為10 min,培育時間為3~5 h,βG酶活性比其他2個攪拌時間下βG酶活性更低。

    在NAG酶活性變化圖中,3條曲線的趨勢比較相似(圖1d)。3個不同攪拌時間下,在培育時間6 h時均達(dá)到最大值,分別為202、231、218 nmol·h-1·g-1。在培育時間為3~5 h時,攪拌時間10 min與20 min對其酶活性的影響比較小,在78~164 nmol·h-1·g-1范圍內(nèi)波動。

    因此,根據(jù)攪拌時間和培育時間對上述4種水解酶活性的影響結(jié)果,以及各參考文獻(xiàn)中所采用的培育時間,本實(shí)驗將“培育時間”這一影響因素的范圍設(shè)定為3~5 h。

    圖 1 不同攪拌時間和培育時間對土壤酶活性的影響Figure 1 Effects of different stirring time and incubation time on soil enzyme activity

    表 3 土壤水解酶的模型方差參數(shù)Table 3 Model variance parameters of soil hydrolases

    酶類型樣地F值P值校正系數(shù)R2AP酶N112.740.4260.38%N21.260.3961.85%N313.64<0.05?94.60%P113.93<0.05?94.71%P213.53<0.05?94.56%P312.15<0.05?93.99%CBH酶N1102.49<0.000 1??99.25%N224.82<0.05?96.96%N321.04<0.05?96.43%P138.66<0.000 1??98.03%P26.8<0.05?89.74%P33.380.0681.31%βG酶N129.61<0.000 1??97.44%N217.27<0.05?95.69%N39.41<0.05?92.37%P18.61<0.05?91.71%P214.93<0.05?95.05%P33.85<0.05?83.18%NAG酶N19.52<0.05?92.45%N218.05<0.05?95.87%N325.96<0.05?97.09%P113.63<0.05?94.60%P26.7<0.05?89.60%P312.43<0.05?94.11%

    注:*顯著性差異(P<0.05);**極顯著性差異(P<0.001)。

    2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化測試方法

    采用Design-Expert 8.0.6軟件對實(shí)驗結(jié)果進(jìn)行分析,得到每個樣地中每種酶模型的方差分析表(表3)。實(shí)驗結(jié)果表明,N1、N2樣地中AP酶和P3樣地中CBH酶的模型顯示結(jié)果不顯著,其他模型結(jié)果均顯著。

    以樣品土壤的最高酶活性為目標(biāo),以攪拌時間、靜置時間和培育時間為優(yōu)化對象,利用Design-Expert 8.0.6軟件對上述模型進(jìn)行了優(yōu)化處理,將實(shí)驗數(shù)據(jù)代入到軟件中可得到實(shí)驗最優(yōu)的處理方案(表4)。結(jié)果表明,在酶活性測試中,靜置時間為0 h效果最佳,即,使用保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)下的懸濁液可以使96微孔板中的土壤樣品獲得最高的酶活性。這也從另外一個方面說明,土壤酶與腐殖質(zhì)、膠體等結(jié)合緊密。而對于培育時間而言,實(shí)驗發(fā)現(xiàn)4 h是最佳的。不同水解酶的最適攪拌時間略有差異,分別是:AP酶攪拌12.02 min時可以得到酶活性最大值;CBH酶攪拌14.3 min時可以得到酶活性最大值;βG酶攪拌19.6 min時可以得到酶活性最大值;NAG酶攪拌20.03 min時可以得到酶活性最大值。因為測量土壤酶活性時,一個土壤樣品經(jīng)過處理后會同時測定這4種酶的活性,所以取最優(yōu)攪拌時間為16.48 min。

    表 4 最佳處理時間參數(shù)Table 4 Optimal processing time parameter

    根據(jù)上述結(jié)果,可以確定靜置時間最佳效果是0 min,在這個結(jié)果之下,根據(jù)軟件可以繪制出攪拌時間及培育時間雙因子效應(yīng)分析圖(圖2~圖5)。2個因素之間的影響幾乎沒有極大值點(diǎn),變化趨勢一直在增加。從圖2可以看出,不同攪拌時間下,在N1、P3中,培育時間一定的條件下,AP酶活性隨著攪拌時間的增加表現(xiàn)為先增加后降低;在N2中,AP酶活性隨著培育時間的延長呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢,在攪拌時間為20 min,培育時間為4 h時,AP酶活性最高;而在P2中,AP酶活性則呈現(xiàn)出現(xiàn)隨攪拌時間增加的趨勢。由圖3得出,N1、N2、N3的CBH酶活性在不同的攪拌時間下無顯著差異,而P2、P3的CBH酶活性隨著攪拌時間的變化表現(xiàn)為先增加后降低。N3、P2、P3中,培育4 h時,βG酶活性達(dá)到最大值。此外,在N1中,隨著攪拌時間和培育時間的延長,NAG酶活性增加;在P1中,在攪拌時間一定的情況下,隨著培育時間的增加,NAG酶活性出現(xiàn)先增加后降低的趨勢,而P1、P2在培育時間一定的條件下,NAG酶活性隨著攪拌時間的變化表現(xiàn)為先增加后降低。

    圖 2 攪拌時間和培育時間對不同土壤AP酶活性影響的響應(yīng)曲面Figure 2 Response surfaces of soil AP enzyme activity influenced by stirring time and incubation time

    2.3 對比實(shí)驗

    根據(jù)實(shí)驗結(jié)果得出的最優(yōu)參數(shù)方案——攪拌時間16.48 min、靜置時間0 min、培育時間4 h,與當(dāng)前常用的低功率超聲波預(yù)處理法進(jìn)行對比實(shí)驗(表5)。結(jié)果顯示2種方法測到酶活性的sig值均大于0.05,差異不顯著。因此,2種土壤的預(yù)處理方法對實(shí)驗影響差別不大,說明在有限的實(shí)驗室條件下采用相對便捷、成本低的攪拌機(jī)破碎法,并結(jié)合本研究的優(yōu)化方案進(jìn)行酶活性測定的前處理亦能得出較好的實(shí)驗結(jié)果。

    在最優(yōu)參數(shù)條件下,將天然常綠闊葉林與杉木人工林的土壤水解酶活性進(jìn)行對比檢驗實(shí)驗,結(jié)果顯示兩種樣地的土壤樣品sig值大于0.05,證明林分因素對實(shí)驗結(jié)果沒有顯著影響。

    圖 3 攪拌時間和培育時間對不同土壤CBH酶活性影響的響應(yīng)曲面Figure 3 Response surfaces of soil CBH enzyme activity influenced by stirring time and incubation time

    圖 4 攪拌時間和培育時間對不同土壤βG酶活性影響的響應(yīng)曲面Figure 4 Response surfaces of soil βG enzyme activity influenced by stirring time and incubation time

    圖 5 攪拌時間和培育時間對不同土壤NAG酶活性影響的響應(yīng)曲面Figure 5 Response surfaces of soil NAG enzyme activity influenced by stirring time and incubation time

    3 討論

    表 5 配對檢驗結(jié)果Table 5 Pairing test results

    處理實(shí)驗結(jié)果d.f.Sig.AP酶超聲波破碎法×AP酶攪拌機(jī)破碎法681.01~1 206.9250.182CBH酶超聲波破碎法×CBH酶攪拌機(jī)破碎法44.48~ 31.7150.223βG酶超聲波破碎法×βG酶攪拌機(jī)破碎法215.89~183.8750.765NAG酶超聲波破碎法×NAG酶攪拌機(jī)破碎法139.60 ~106.4150.326天然常綠闊葉林×杉木人工林568.61~903.8840.355

    影響土壤酶活性測試結(jié)果的原因有很多,本次實(shí)驗結(jié)果表明,在所選的3個實(shí)驗參數(shù)中,攪拌時間對酶活性測試的結(jié)果影響較大。土壤團(tuán)聚體是在土壤有機(jī)碳、生物相、離子鍵橋、黏粒和碳酸鹽共同作用下結(jié)合起來的[22-23],是土壤結(jié)構(gòu)的基本單元[24-25]。土壤的預(yù)處理是通過對各土壤團(tuán)聚體的破壞使其中的各種酶有機(jī)會與底物溶液充分接觸,因此,磁力攪拌機(jī)對樣品溶液的攪拌時間不同,對團(tuán)聚體的破碎效果也不同,從而影響到土壤中水解酶活性的測定。培育則是給土壤水解酶消耗底物的時間,培育時間過短,土壤酶對底物消耗不完全,培育時間過長會降低實(shí)驗效率。因為土壤酶與膠體和腐殖質(zhì)等結(jié)合緊密,所以土壤樣品溶液的均質(zhì)化程度會影響其中各種水解酶活性的測試結(jié)果,實(shí)驗過程中也要注意磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速。

    底物濃度也是影響酶活性測試的原因之一。有研究結(jié)果證明,土壤酶促反應(yīng)受底物濃度的影響[24],在本實(shí)驗中,使用的底物濃度是400 μmol·L-1,高濃度加快了酶對底物的消耗速率。在此底物濃度的條件下所得到的培育時間參數(shù)是4 h。若是底物的濃度變化,土壤酶熒光測試法的最優(yōu)培育時間參數(shù)可能也會隨之變化。試驗結(jié)果表明,攪拌法預(yù)處理土壤樣品和目前國際上常用的超聲破碎法預(yù)處理土壤樣品對土壤酶活性的影響無顯著差異,表明本試驗方法具有成本低、操作簡便以及可批量操作的優(yōu)勢。

    亞熱帶森林是全球森林碳吸收量最高的地區(qū)之一[26],常綠闊葉林和杉木針葉林是亞熱帶區(qū)域的重要植被類型[27]。確定適當(dāng)?shù)拿富钚詼y定方法,對了解亞熱帶地區(qū)地下生態(tài)過程具有重要的意義。然而web of science的檢索結(jié)果表明,亞熱帶區(qū)域森林土壤酶研究在國際期刊上少見,說明土壤酶的研究和測量還需要更多的投入,隨著meta分析的應(yīng)用,正確測量土壤酶活性愈加重要。因此,本研究結(jié)果有助于提高對森林生態(tài)系統(tǒng)的認(rèn)識,可以為森林土壤的酶活性快速檢測提供參考。

    4 結(jié)論

    在單因素實(shí)驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法建立了常綠闊葉林和杉木針葉林土壤常見的4種水解酶的酶活性與攪拌時間、靜置時間、培育時間關(guān)系的模型。分析得出在攪拌16.48 min、靜置0 min和培育4 h后能獲得當(dāng)前處理下水解酶活性測試最優(yōu)效果。本實(shí)驗所用的酶底物濃度已經(jīng)是優(yōu)化后的數(shù)據(jù),加上攪拌時間、靜置時間和培育時間這3個參數(shù),構(gòu)成了這幾種土壤酶測試的所有關(guān)鍵因素,因此本實(shí)驗結(jié)論可以為亞熱帶森林土壤酶研究提供參考。

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