替米沙坦對胰島素抵抗大鼠胰島蛋白酪氨酸磷酸酶1B表達的影響

喬 晶,薛靜靜,王 彥

(1山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科,太原 030001;2山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科;3山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科;*通訊作者,E-mail:wyroad@126.com)

我國是糖尿病的重災(zāi)區(qū),成人糖尿病患者人數(shù)居全球第一[1]。糖尿病具有較高的致殘率和致死率,且常與高血壓病伴隨出現(xiàn)[2,3]。眾所周知,糖尿病患者肝臟、肌肉、脂肪組織等靶器官存在胰島素抵抗(IR)。Xu等[4]研究證實,高脂誘導(dǎo)的肥胖大鼠的胰島細胞也存在IR,而胰島素受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙是其發(fā)生IR的重要機制之一。蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP-1B)是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵分子,負(fù)調(diào)控胰島素信號通路,成為糖尿病治療的新靶點[5]。替米沙坦是血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑類降壓藥物,可改善IR,保護胰島功能[6]。那么替米沙坦是否可通過影響胰島PTP-1B表達來增強胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),保護胰島功能?目前尚缺乏相關(guān)報道。本研究通過觀察替米沙坦對長期高糖高脂膳食誘導(dǎo)的IR大鼠胰島PTP-1B表達的影響,探討替米沙坦保護胰島功能的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級6-8周齡雄性SD大鼠40只,體質(zhì)量180-200 g,購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心。

1.2 主要試劑與儀器

替米沙坦片購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團有限責(zé)任公司,胰島素ELISA試劑盒購自上海將來實業(yè)股份有限公司,免疫組化染色孵育盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,兔抗鼠PTP-1B多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,山羊抗兔/鼠IgG抗體pv6000購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。血糖儀購自美國強生公司,全自動生化分析儀購自深圳邁瑞公司。

1.3 高糖高脂大鼠模型的建立

40只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,隨機分為4組(n=10)。對照組給予普通飼料喂養(yǎng),高糖高脂組(HSHF組)、替米沙坦5 mg組(T5 mg組)和替米沙坦10 mg組(T10 mg組)均給予高糖高脂飼料(70%正常飼料,20%豬油,10%蔗糖,1%膽固醇,0.25%膽酸)喂養(yǎng),兩種飼料由山西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。大鼠分籠喂養(yǎng),環(huán)境溫度為22-26 ℃,濕度為55%-60%,每日光照時間為12 h,自由攝食及進水。

1.4 干預(yù)方法

對照組普通飼料喂養(yǎng),其余組高糖高脂飼料喂養(yǎng),第24周末,NC組繼續(xù)飼予普通飼料并灌胃給予2 ml生理鹽水,HSHF組繼續(xù)飼予HSHF飼料并灌胃給予2 ml生理鹽水,T5 mg組和T10 mg組繼續(xù)飼予HSHF飼料并分別灌胃給予溶于2 ml生理鹽水的替米沙坦5 mg/(kg·d)和10 mg/(kg·d),以上處理均持續(xù)12周,灌胃1次/d。

1.5 空腹血糖、甘油三酯、胰島素的測定

隨機取各組大鼠6只,大鼠禁食15 h,稱體質(zhì)量,烏拉坦4 ml/kg腹腔注射麻醉,腹主動脈采血,全部血標(biāo)本經(jīng)3 000 r/min,離心10 min,取分離后的血漿,血糖儀測定空腹血漿葡萄糖糖(FPG),將分離后的血清分裝于無菌EP管內(nèi),全自動生化分析儀測定甘油三酯(TG),ELISA試劑盒測定空腹胰島素(FINS),計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=(FPG×FINS)/22.5。

1.6 檢測大鼠胰島PTP-1B蛋白的表達

第36周末，處死大鼠取胰腺組織置于10%中性甲醛溶液固定，用石蠟包埋，2 μm厚度切片，56 ℃烤箱過夜，常規(guī)脫蠟、水化，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性15 min，蒸餾水洗5 min，PBS洗2 min×3次，放入枸櫞酸緩沖液高壓鍋中加熱至沸騰，進行抗原修復(fù)2 min，冷卻后，PBS洗2 min×3次，加入一抗(濃度1 ∶100的PTP-1B抗體)，37 ℃溫箱孵育1 h，PBS洗2 min×3次，加入二抗(山羊抗兔/鼠IgG抗體)，37 ℃溫箱孵育20 min，PBS洗2 min×3次，DAB顯色，蘇木精復(fù)染2 min、脫水、透明封片，顯微鏡下觀察，陽性反應(yīng)是細胞質(zhì)染成棕色，采用美國aperio公司scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)掃描并用半定量對陽性著色單位面積灰度進行分析，每個切片，盲法取6個視野，光密度值OD=log(240/灰度)為量化指標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠FPG、FINS、TG、HOMA-IR的比較

與對照組比較,HSHF組的FPG、FINS、TG水平及HOMA-IR均明顯升高(P<0.05)。與HSHF組比較,T5 mg組和T10 mg組的FPG、FINS、TG水平及HOMA-IR均顯著低于HSHF組(P<0.05,見表1),且T5 mg組和T10 mg組各指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 大鼠FPG、FINS、TG、HOMA-IR的比較 (n=6)Table 1 Comparison of FPG, FINS, TG, HOMA-IR in rats among four groups (n=6)

與NC組比較,*P<0.05;與HSHF組比較,#P<0.05;與T5 mg組比較,&P<0.05

2.2 大鼠胰島PTP-1B表達的比較

陽性顆粒呈棕黃色,定位于胞漿(見圖1)。第36周末,PTP-1B OD值NC組為0.07±0.002,HSHF組為0.10±0.006,T5 mg組為0.10±0.002,T5 mg組為0.09±0.002。與NC組相比,HSHF組PTP-1B表達升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與HSHF組相比,T5 mg組PTP-1B表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.001),T10 mg組PTP-1B表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與T5 mg組相比,T10 mg組PTP-1B表達降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002)。

圖1 大鼠免疫組化胰島PTP-1B蛋白表達 (×400)Figure 1 Expression of PTP-1B protein in islet of rats in each group (×400)

3 討論

蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一員,它是多受體酪氨酸激酶(RTKs)的負(fù)調(diào)節(jié)因子,與多種信號通路相關(guān)聯(lián)[7]。近年研究證實,胰島細胞也存在胰島素抵抗(IR),胰島素信號是通過胰島素受體及其下游靶點的酪氨酸磷酸化來介導(dǎo)的[8-10]。蛋白酪氨酸磷酸酶可通過去磷酸化激活胰島素受體復(fù)合物中的特異性酪氨酸殘基以抑制胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[11]。張麗娟等[12]通過研究高脂膳食誘導(dǎo)的肥胖大鼠胰腺中PTP-1B的表達,觀察到肥胖組的FINS、TG和HOMA-IR明顯高于對照組,胰腺中PTP-1B表達水平增加,胰島素受體(IR)和胰島素受體底物1(IRS-1)的酪氨酸磷酸化程度減弱,胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被抑制,提示PTP-1B是大鼠發(fā)生胰島細胞IR的主要調(diào)控因子。吳鴻等[13]研究證實當(dāng)胰島β細胞內(nèi)PTP-1B過表達時,可降低胰島素受體IRβ和胰島素底物IRS-1的磷酸化,使胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生障礙,胰島細胞出現(xiàn)IR。Cicirelli等[14]給非洲爪蟾卵母細胞注射微量PTP-1B,可抑制胰島素刺激的酪氨酸磷酸化過程。

血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARBs)能夠降低新發(fā)糖尿病患病率[15],但其改善糖代謝的機制尚未完全闡明。閆文華等[16]探討了ARB類降壓藥物坎地沙坦對高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠的脂肪組織中PTP-1B的影響,與高脂組大鼠相比,坎地沙坦組大鼠脂肪組織中PTP-1B的mRNA和蛋白表達含量顯著降低,推測坎地沙坦可能通過減少脂肪組織中PTP-1B基因和蛋白的表達改善了胰島素的敏感性。其他ARB類降壓藥物對胰島PTP-1B的影響目前尚未報道,此途徑是否為ARB類藥物的類效應(yīng)?

替米沙坦也是ARB類降壓藥物,研究證實其可通過減少胰島細胞脂肪堆積、抗炎、抗氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等改善胰島細胞的胰島素抵抗[17],但其對胰島PTP-1B表達影響的相關(guān)報道罕見。本研究中,高糖高脂膳食誘導(dǎo)的IR大鼠經(jīng)替米沙坦干預(yù)后,TG、FPG、FINS水平和HOMA-IR均顯著降低(P<0.05),且T10 mg組大鼠的TG、FPG、FINS水平和HOMA-IR下降程度比T5 mg組大鼠的下降程度更顯著(P<0.05),提示替米沙坦能夠改善高糖高脂喂養(yǎng)大鼠的IR,且呈劑量依賴性。與正常對照組比較,高糖高脂組大鼠胰島PTP-1B表達顯著升高(P<0.05),T5 mg組和T10 mg組胰島PTP-1B表達顯著降低(P<0.05),提示替米沙坦可能是通過下調(diào)胰島PTP-1B的表達改善了IR大鼠的胰島功能,從而改善了糖代謝。

如前所述,替米沙坦可抑制胰島PTP-1B的表達,這可能是其改善胰島素抵抗、保護胰島功能的機制之一。目前關(guān)于替米沙坦影響PTP-1B的具體機制的報道少見,Akasaki等[18]研究證實過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)激動劑曲格列酮能通過PPAR-γ依賴性途徑影響PTP-1B蛋白的表達活性,而替米沙坦同樣作為一種選擇性PPAR-γ激動劑,可影響參與糖脂質(zhì)代謝,進而改善胰島素抵抗[19]。那么,替米沙坦是否會通過PPAR-γ介導(dǎo)的途徑來影響PTP-1B蛋白的活性,仍待進一步深入研究。