三七粉聯(lián)合玻璃體切除術(shù)對增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的療效觀察及機理探究

韓夢雨 ，王志軍，李偉，高征，秦亞麗，鄧婷婷，訾迎新，鄧宇，金明

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是目前工作年齡人群第一位的致盲性疾病[1]。增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變（proliferative diabetic retinopathy，PDR）是DR 的增殖階段，其特點是視網(wǎng)膜缺血、缺氧和異常新生血管形成，導(dǎo)致玻璃體出血和牽引性視網(wǎng)膜脫離等病變。PDR 是導(dǎo)致非外傷性玻璃體積血首要原因，嚴(yán)重危害患者視力甚至致盲[2-6]。玻璃體切除術(shù)是目前臨床上治療PDR 引發(fā)玻璃體積血的主要方式，但病理性新生血管與視網(wǎng)膜粘連緊密，不僅術(shù)中極易出現(xiàn)醫(yī)源性視網(wǎng)膜裂孔及大量出血，而且術(shù)后視力恢復(fù)差，易出現(xiàn)黃斑水腫、牽拉性視網(wǎng)膜脫離、玻璃體再次出血等并發(fā)癥，對醫(yī)生和患者均會帶來一定挑戰(zhàn)與壓力[7]。三七粉為五加科植物三七的根及根莖，相關(guān)研究[3-4]表明其對玻璃體積血、視網(wǎng)膜出血等眼底血證具有較好的療效。本研究通過觀察比較2 組患者術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后臨床療效差別，檢測2 組患者玻璃體原液血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）的濃度差異，研究單味三七粉聯(lián)合玻璃體切除術(shù)組患者與單純行玻璃體切除術(shù)組患者的臨床療效差別及其潛在機理所在。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2016 年1 月—2017 年9 月就診于中日友好醫(yī)院眼科的PDR 患者（均為2 型DM)共29 例（29只眼）。將受試患者按初次就診時間選擇簡單隨機（拋硬幣）法分為治療組和空白組，治療組14 例，男性8 例，女性6 例；年齡（54.57±11.47）歲；糖尿病病程（10.86±7.32）年；空腹血糖（6.6±1.28）mmol/L；糖化白蛋白（glycated albumin,GA）（13.51%±1.97%）；甘油三酯（2.02±1.97）mmol/L；總膽固醇（3.02±1.97）mmol/L；眼壓（13.93±2.09）mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）；最佳矯正視力（bestcorrected visual acuity，BCVA）＞0.5 者1 只眼，0.3～≤0.5 者1 只眼，0.1～≤0.3 者4 只眼，0.05～≤0.1者2 只眼，≤0.05 者6 只眼。空白組15 例，男性9 例，女性6 例；年齡（51.13±11.84）歲；糖尿病病程（11.40±4.61）年；空腹血糖（6.50±1.12）mmol/L；GA（13.60%±2.03%）；甘油三酯（1.53±0.52）mmol/L；總膽固醇（2.67±0.89）mmol/L；眼壓（14.00±2.56）mmHg；BCVA＞0.5 者1 只眼，0.3～≤0.5者1 只眼，0.1～≤0.3 者2 只眼，0.05～≤0.1 者2 只眼，≤0.05 者9 只眼。2 組患者性別、年齡、空腹血糖、GA、糖尿病病程、甘油三酯、總膽固醇、眼壓、BCVA等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)、納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

PDR 診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：（1）出現(xiàn)視網(wǎng)膜新生血管（neovascular elsewhere，NVE）或視乳頭新生血管（neovascular of the disc，NVD），當(dāng)NVD＞1／4～1／3 視乳頭直徑（papilla diameter，PD）或NVE＞1／2PD，或伴視網(wǎng)膜前出血或玻璃體出血時稱“高危增生型”（high risk PDR）；（2）出現(xiàn)纖維膜，可伴視網(wǎng)膜前出血或玻璃體出血；（3）牽拉性視網(wǎng)膜脫離，合并纖維膜，可合并或不合并玻璃體積血，也包括虹膜和房角的新生血管。

玻璃體積血分級標(biāo)準(zhǔn)[9]：I 級 玻璃體積血，可見視乳頭及視網(wǎng)膜血管；II 級 輕度玻璃體積血，模糊可見視乳頭；III 級 中度玻璃體積血，看不見視乳頭及視網(wǎng)膜血管，可見眼底紅光反射；IV 級 重度玻璃體積血，看不見眼底，也無眼底紅光反射。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）自愿參加本臨床試驗，簽署知情同意書；（2）診斷明確（由同一位醫(yī)師），玻璃體積血II 級以上，且玻璃體積血病程≤2 周；（3）空腹血糖控制在3.9～8.0 mmol/L 以內(nèi)，糖化白蛋白11.0%～16.0%，高血壓患者血壓控制在130/80 mm Hg 以下；（4）患者均為第1 次手術(shù)，并在術(shù)前3 個月內(nèi)未接受過藥物玻璃體腔注射及全視網(wǎng)膜光凝治療。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴新生血管性青光眼和(或)嚴(yán)重白內(nèi)障的PDR 患者；（2）有嚴(yán)重的全身性疾病、年齡較大、近期發(fā)生過心腦血管意外的患者；（3）有可能影響視力的其他眼部疾病的患者；（4）凝血功能指標(biāo)異常者；（5）排除其他疾病引起的單純的玻璃體積血及視網(wǎng)膜脫離等；（6）玻璃體積血病程＞2 周者。

1.3 治療方法

治療組給予中日友好醫(yī)院中藥制劑室供應(yīng)的三七粉4.5 g，沖服，每日2 次（時間為8:00 和20:00），2周后行玻璃體切除術(shù)。

空白組不予任何干預(yù)，2 周后行玻璃體切除術(shù)。

手術(shù)過程：2 組患者由同一位高年資醫(yī)師在局部球后麻醉下完成手術(shù)，采用Alcon consellation 玻切超乳一體機、23G 三通道睫狀體平坦部玻璃體切除術(shù)，術(shù)中所有患者先行白內(nèi)障超聲乳化，術(shù)中切除混濁玻璃體及積血，剝除病理性新生血管膜解除牽拉，并行全視網(wǎng)膜激光光凝術(shù)，如遇視網(wǎng)膜已脫離的情況，術(shù)中根據(jù)需要選擇眼內(nèi)填充物(硅油、惰性氣體或平衡鹽溶液等)，最后植入人工晶狀體，關(guān)閉三通道。

1.4 觀察指標(biāo)及檢查方法

BCVA：采用標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)視力表檢測視力后經(jīng)同一位驗光師驗光矯正。

眼壓：采用日本Topcon 公司非接觸式眼壓計測定，連續(xù)測定3 次，取平均值；

玻璃體積血吸收程度：眼部B 超（天津索微）評估玻璃體積血吸收體積；光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomography,OCT）（日本Topcon 公司）評估視網(wǎng)膜黃斑中央凹厚度；熒光素眼底血管造影（fluorescein fundus angiography,FFA）（德國海德堡血管造影儀HRA plus II）評價視網(wǎng)膜微血管瘤、出血、滲出面積及新生血管變化等。

手術(shù)時間：德國Zeiss 手術(shù)錄像系統(tǒng)記錄術(shù)中手術(shù)時間。

玻璃體原液取材方法：所有患者術(shù)眼常規(guī)術(shù)前使用復(fù)方托吡卡胺滴眼液0.5 h 快速散瞳，手術(shù)室內(nèi)常規(guī)消毒鋪無菌孔巾，0.75%布比卡因、2%利多卡因等比例混合后球后注射5.0～6.0 mL。于術(shù)中行標(biāo)準(zhǔn)三通道經(jīng)睫狀體平坦部玻璃體切割術(shù)，預(yù)置灌注頭，玻璃體切割頭及導(dǎo)光照明纖維進入眼內(nèi)，玻璃體切割手術(shù)開始時關(guān)閉灌注管，于切割器開口處用無菌2 mL注射器吸引切割出的非稀釋的玻璃體原液0.5～0.8 mL，分成2 份移入已消毒的Eppendorf 管中（每個Eppendorf 管中約250～300 μL），液氮轉(zhuǎn)運至-80℃冰箱保存在中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所生物樣本庫。

VEGF、FN 濃度：VEGF、FN 濃度的測量使用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法，人VEGF、FN 酶聯(lián)免疫試劑盒購自北京瑞格博生物公司，根據(jù)試劑盒操作說明書進行操作。使用前先將試劑盒室溫下平衡0.5 h?？瞻卓撞患訕?，只加顯色劑A、B 和終止液用于調(diào)零。標(biāo)準(zhǔn)品孔中每孔加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，零孔加入樣品稀釋液50 μL，在各孔中加入生物素化抗原工作液50 μL。樣品孔中加入稀釋2 倍樣品50 μL，加入生物素化抗原工作液50 μL，輕輕搖晃，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃溫箱孵育60 min；清洗5 次后每孔再加入親和素-HRP50 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃孵箱孵育60 min；然后第二次洗滌（清洗5 次）后，在每孔中加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min 后在每孔中加入終止液50 μL，（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）酶標(biāo)儀450 nm 處讀數(shù)，在10 min 內(nèi)測定各孔吸光度（OD）值，根據(jù)定比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的OD 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品OD 值和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算VEGF 含量。FN 的檢測步驟與VEGF 相同（樣品孔使用原液檢測）。實驗操作均嚴(yán)格按其說明書操作程序進行測定，且每份標(biāo)本均重復(fù)3 次測定。

1.5 療效標(biāo)準(zhǔn)

玻璃體積血吸收療效標(biāo)準(zhǔn)[10-11]：（1）顯效 玻璃體積血基本吸收，由Ⅲ～Ⅳ級轉(zhuǎn)化為Ⅰ級；視力提高大于2～3 行；從無光感增加到0.05；手動／眼前增加到0.1；FFA 微血管瘤數(shù)量、滲出面積、出血3 項中有2 項以上改善，且B 超檢查結(jié)果顯示玻璃體腔內(nèi)混濁光團數(shù)明顯降低；（2）有效 玻璃體積血大部分吸收，由Ⅲ～Ⅳ級轉(zhuǎn)化為Ⅱ級；視力提高大于1～2 行；從無光感增加到0.02；手動／眼前增加到0.08；FFA微血管瘤數(shù)量、滲出面積、出血3 項中有1 項以上改善，且B 超檢查結(jié)果顯示腔內(nèi)混濁光團數(shù)有所降低；（3）無效 玻璃體積血少部分或無吸收，眼底結(jié)構(gòu)仍窺不清。視力無改善甚至加重；FFA 微血管瘤數(shù)量、滲出面積、出血3 項中無改善，且B 超檢查結(jié)果顯示腔內(nèi)混濁光團數(shù)無改善?？傆行剩?）=（顯效+有效）/患者只眼×100%。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

運用SPSS20.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，正態(tài)分布計量資料采用獨立樣本t 檢驗或單因素方差分析，非正態(tài)數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)前2 組患者BCVA 改善及玻璃體積血吸收情況

BCVA 治療組視力提升4 只眼，空白組視力提升0 只眼，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-2.64，P=0.010）（表1）。

表1 2 組患者術(shù)前干預(yù)2 周及術(shù)后3 個月視力改善情況（眼只數(shù)）

玻璃體積血吸收情況 治療組玻璃體積血顯效2 只眼，有效5 只眼，無效7 只眼，積血吸收改善7 只眼，總有效率50%；空白組玻璃體積血顯效0 只眼，有效2 只眼，無效13 只眼，積血吸收改善2只眼，總有效率13.3%，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.55，P=0.030）。

2.2 術(shù)中手術(shù)時間

治療組（23.13±7.84）min，空白組（28.74±4.29）min，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.42，P=0.020）。

2.3 術(shù)后3 個月的視力及眼壓

BCVA：治療組14 例14 只眼患者中，視力提高9 只眼(64.0%)；空白組15 例15 只眼患者中，視力提高5 只眼(33.0%)，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.12，P=0.030)（表1）。

眼壓：治療組眼壓（16.14±4.06）mm Hg，空白組眼壓（19.13±2.75）mm Hg。組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.34，P=0.030）。

2.4 2 組患者間玻璃體中VEGF 及FN 濃度

治療組VEGF 濃度（224.91±41.10）pg/mL，空白組VEGF 濃度（807.64±98.20）pg/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=20.57，P=0.000）。治療組FN 濃度（3.88±0.19）μg/mL，空白組FN 濃度為（4.29±0.25）μg/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.00，P=0.000）。

3 討論

玻璃體積血是引起PDR 患者視力下降甚至致盲的重要原因，非正常的新生血管形成是導(dǎo)致這一系列眼內(nèi)病理變化的重要致盲因素[12]。玻璃體切除術(shù)是其主要治療方法。但多數(shù)PDR 患者病情比較棘手，術(shù)中難度較大，手術(shù)帶來的可能并發(fā)癥等也局限了玻璃體切除術(shù)在PDR 引起的玻璃體積血中的單一應(yīng)用及治療前景[7]。因此，尋找更加完善的治療方式尤為重要。本研究在術(shù)前未注射抗VEGF 藥物治療，主要考慮，目前PDR 引發(fā)的玻璃體積血患者，術(shù)前抗VEGF 治療尚未得到指南或者專家共識，且相關(guān)文獻認(rèn)[13]為PDR 引發(fā)玻璃體積血的患者術(shù)前抗VEGF 藥物的應(yīng)用有可能會導(dǎo)致PDR 進展。

三七粉為五加科植物三七的根及根莖，為“血證要藥”，具有“止血又活血，止血不留瘀”特點，為中醫(yī)眼科臨床治療PDR 導(dǎo)致的玻璃體積血的常用組分藥物。前期研究表明，三七粉可以通過以下機制發(fā)揮防治PDR 的功用：縮短凝血時間，增加凝血酶濃度，使血小板數(shù)量顯著增加等來發(fā)揮止血作用[14]；糾正血糖、血脂代謝及降低視網(wǎng)膜GFAP 的表達對DR大鼠的視網(wǎng)膜起到保護作用[15-16]；抑制視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞VEGF 的釋放弱化視網(wǎng)膜新生血管生成[17]。

VEGF 是目前研究所知作用最強、最直接的促新生血管生成的細(xì)胞因子之一，且VEGF 與多種眼內(nèi)新生血管性疾病（包括PDR）的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。FN 是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的重要組成部分，目前關(guān)于FN 與PDR 發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究甚少。病理性新生血管是PDR 期典型病理特征，除內(nèi)皮細(xì)胞外，ECM 也與血管的發(fā)生有關(guān)，其在內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、黏附、管腔重構(gòu)中起重要作用。相關(guān)動物實驗提示FN 在DR 大鼠的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞外基質(zhì)中過度表達，促進視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞增生、毛細(xì)血管瘤形成[18]。既往研究也表明FN 刺激視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、巨噬/單核細(xì)胞、T/B 淋巴細(xì)胞等遷移至視網(wǎng)膜前或玻璃體內(nèi),導(dǎo)致病理纖維化及異常增殖等，形成病理性視網(wǎng)膜前膜及牽拉性視網(wǎng)膜脫離等病變[19-21]。在本研究中我們觀察到，治療組患者玻璃體VEGF 及FN 含量明顯低于空白組，我們推測三七粉可以通過抑制PDR 患者VEGF 的表達這一通路，從而阻止視網(wǎng)膜前病理性新生血管的生長，有效促進術(shù)前PDR 患者玻璃體積血吸收、促進患者術(shù)前視力提升、縮短PDR 患者手術(shù)時間、提升患者術(shù)后視力、降低患者術(shù)后高眼壓發(fā)生率。其次，三七粉可以通過抑制PDR 患者玻璃體中FN 的表達從而阻斷其促進ECM 成分合成的過程，進而阻斷或延緩PDR 的視網(wǎng)膜前膜的形成。

本研究突顯出單味中藥三七粉的術(shù)前干預(yù)對PDR 患者臨床治療的潛在療效。三七粉可能通過抑制PDR 患者玻璃體中VEGF 及FN 的表達來發(fā)揮相應(yīng)治療作用?；诖?，可以認(rèn)為單味三七粉口服可作為PDR 導(dǎo)致的玻璃體積血患者術(shù)前輔助治療手段之一。但由于PDR 的形成涉及多種因子，可能存在多條影響途徑，故三七粉是直接作用于這2 種因子來發(fā)揮作用還是通過影響其他細(xì)胞生長因子或炎性因子間接發(fā)揮作用，其進一步的作用機理仍不清晰，需要今后進一步的基礎(chǔ)及臨床試驗來明確，從而有可能為PDR 的臨床防治提供新的有效思路和方法。