長(zhǎng)鏈非編碼 RNA肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響

高玉霞,董學(xué)彩,王文翔,盛修貴

(1.新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院婦瘤一科,河南 新鄉(xiāng) 453000；2.山東省腫瘤醫(yī)院婦瘤科，山東 濟(jì)南 250000)

絨毛膜癌是女性常見的惡性腫瘤之一，多繼發(fā)于葡萄胎、流產(chǎn)或足月分娩以后，少數(shù)發(fā)生于異位妊娠后，偶發(fā)于未婚婦女的卵巢(原發(fā)性絨毛膜癌)[1]。尋求絨毛膜癌的新型分子治療靶點(diǎn)一直是研究的熱點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，LncRNA)被認(rèn)為可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和轉(zhuǎn)移。有研究證明，肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1(actin filament-associated protein 1-antisense RNA1,AFAP1-AS1)與乳腺癌、食管癌、肝癌等密切相關(guān)[2-4]。目前，尚未見關(guān)于LncRNA AFAP1-AS1在絨毛膜癌發(fā)病機(jī)制中作用的相關(guān)研究。基于此，本研究通過構(gòu)建LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)載體，探討LncRNA AFAP1-AS1對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞人絨毛膜癌細(xì)胞JEG-3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究院。

1.2主要試劑與儀器RPMI 1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，TRIzol RNAiso、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，Transwell小室、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、Western blot檢測(cè)試劑盒購(gòu)自蘇州宇恒生物科技有限公司，山羊抗人Caspase-3、Caspase-9蛋白一抗以及山羊抗人Caspase-3、Caspase-9蛋白二抗購(gòu)自美國(guó)Novus Biologicals公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自北京普天新橋技術(shù)有限公司，流式細(xì)胞儀購(gòu)自廣州藝得諾生物科技有限公司，倒置顯微鏡購(gòu)自上海玉研科學(xué)儀器有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀購(gòu)自深圳瑞安康醫(yī)療器械有限公司，凝膠電泳分析系統(tǒng)購(gòu)自英國(guó)CLEAVER公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1人絨毛膜癌細(xì)胞JEG-3的復(fù)蘇及培養(yǎng)將冷凍保存的JEG-3細(xì)胞在37 ℃水中融化，復(fù)蘇后將細(xì)胞株接種于RPMI 1640培養(yǎng)基，加入體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)期間常規(guī)換液。

1.3.2構(gòu)建LncRNAAFAP1-AS1過表達(dá)載體在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索LncRNA AFAP1-AS1的序列，由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)載體，并進(jìn)行基因測(cè)序，實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.3實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù)措施取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，以均勻密度接種于6孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、空白載體組和LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組?？瞻讓?duì)照組細(xì)胞未做任何處理，空白載體組細(xì)胞轉(zhuǎn)染空白載體，LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)載體。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)JEG-3細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9mRNA表達(dá)取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，胰蛋白酶消化，應(yīng)用放射免疫沉淀裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，采用TRIzol法提取細(xì)胞中總RNA，并檢測(cè)RNA純度。取20 μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄操作步驟參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。Caspase-3上游引物序列為5′-CAAGAGGTCCTGTCTTCAGATGA-3′，下游引物序列為5′-TCTGTTTCCGTTTCCTGGTTC-3′；Caspase-9上游引物序列為5′-GTGATAAAGGTTTCGGTTGCTG-3′，下游引物序列為5′-TGTTTTCTGTGGCTCCTCCTC-TGG-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次；每個(gè)樣本重復(fù)3次。采用2-△△CT法計(jì)算Caspase-3和Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5Westernblot法檢測(cè)JEG-3細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng) 48 h 的細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后接種于96孔板，調(diào)整細(xì)胞密度為每孔1×108個(gè)，加入1 mL放射免疫沉淀細(xì)胞裂解液，各組細(xì)胞在冰上裂解30 min，收集1.5 mL裂解后細(xì)胞溶液于離心管中，在預(yù)冷 4 ℃ 的離心機(jī)中 5 000 r·min-1離心5 min，取上清液，95 ℃煮沸后應(yīng)用二喹啉甲酸法檢測(cè)總蛋白濃度。取40 μg總蛋白，將其在120 g·L-1十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，采用電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，室溫條件下 50 g·L-1脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗山羊抗人Caspase-3、Caspase-9蛋白抗體(110 000)，4 ℃ 孵育過夜；磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate buffered saline tween，PBST)稀釋液洗滌3次；加入山羊抗人Caspase-3和Caspase-9蛋白二抗(11 000)孵育2 h，PBST稀釋液洗滌3次；二氨基聯(lián)苯胺顯影液處理樣本。采用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.3.6CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力空白對(duì)照組、空白載體組及LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，按照CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行操作，將3組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞以5×107L-1密度接種于96孔板，72 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃下孵育箱中避光孵育24 h。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3.7Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力收集3組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2.5×109L-1待用。按照試劑盒說明書中的操作步驟檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。將基底膜的基質(zhì)原液儲(chǔ)存于4 ℃冰箱，隔夜融化，然后將經(jīng)過預(yù)冷的無血清RPMI-1640與其按31的比例調(diào)配上室凝膠液體，在Transwell小室的上室中每孔用55 μL凝膠液體進(jìn)行包被，置于37 ℃恒溫孵育箱中孵育2 h，等待上室成膠。然后在上室內(nèi)接種200 μL細(xì)胞懸液，在下室中加入500 μL RPMI-1640培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清)。取Transwell板置于37 ℃恒溫孵育箱內(nèi)孵育培養(yǎng)24 h，以結(jié)晶紫染色劑進(jìn)行染色，應(yīng)用倒置光學(xué)顯微鏡觀察并拍照，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，取均值。

1.3.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)JEG-3細(xì)胞凋亡情況取3組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，胰蛋白酶消化后接種于96孔板，每孔1×108個(gè)細(xì)胞；取1 mL細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，4 ℃ 1 000 r·min-1離心10 min，取沉淀物，PBS沖洗3次，加入結(jié)合緩沖液200 μL，并加入Annexin V和PI各5 μL，避光條件下充分反應(yīng)15 min，加入結(jié)合緩沖液400 μL，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)60 min內(nèi)細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié)果

2.13組JEG-3細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見表1和圖1。LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組JEG-3細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于空白對(duì)照組和空白載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組和空白載體組JEG-3細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表13組JEG-3細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

組別Caspase-3 mRNACaspase-9 mRNACaspase-3蛋白Caspase-9 蛋白空白對(duì)照組0.129±0.0040.464±0.0080.165±0.0220.235±0.021空白載體組0.131±0.0020.512±0.0070.171±0.0270.241±0.024LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組1.121±0.209a1.171±0.139a1.273±0.231a1.413±0.091a

注：與空白對(duì)照組和空白載體組比較aP<0.05。

A：空白對(duì)照組；B：空白載體組；C：LncRNA AFAP1-ASI過表達(dá)組。

圖13組JEG-3細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)(Westernblot)

Fig.1ExpressionofCaspase-3,Caspase-9proteininJEG-3cellsinthethreegroups(Westernblot)

2.23組JEG-3細(xì)胞增殖能力比較空白對(duì)照組、空白載體組及LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組JEG-3細(xì)胞吸光度值分別為0.45±0.04，0.40±0.05，0.28±0.02。LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組JEG-3細(xì)胞的增殖能力(吸光度值)低于空白對(duì)照組和空白載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組與空白載體組JEG-3細(xì)胞增殖能力(吸光度值)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.33組JEG-3細(xì)胞遷移能力比較結(jié)果見圖2?？瞻讓?duì)照組、空白載體組及LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組中透過分子篩的細(xì)胞數(shù)分別為(142.11±18.39)、(131.32±14.02)、(52.11±4.09)個(gè)。LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組透過分子篩的細(xì)胞數(shù)顯著低于空白載體組和空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組和空白載體組透過分子篩的細(xì)胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A：空白對(duì)照組；B：空白載體組；C： LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組。

圖23組JEG-3細(xì)胞遷移能力(結(jié)晶紫染色，×400)

Fig.2MigrationofJEG-3cellsinthethreegroups(crystalvioletdyeing,×400)

2.43組細(xì)胞凋亡率比較結(jié)果見圖3?？瞻讓?duì)照組、空白載體組及LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率分別為(4.21±1.24)%、(3.09±1.13)%、(35.21±13.31)%。LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)載體組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對(duì)照組和空白載體組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；空白對(duì)照組與空白載體組細(xì)胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

A:空白對(duì)照組;B:空白載體組;C:LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組。

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況

Fig3Apoptosisofthecellsinthethreegroupsdetectedbyflowcytometry

3 討論

LncRNA本身不具有編碼蛋白及轉(zhuǎn)錄功能,其長(zhǎng)度不超過200個(gè)片段。LncRNA已經(jīng)被證實(shí)在相關(guān)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡過程中起十分重要的作用。既往研究表明，LncRNA是肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌及肝癌等發(fā)生、發(fā)展中的重要轉(zhuǎn)錄因子，并且與腫瘤瘤體的體積大小及患者的臨床分期密切相關(guān)[5-6]。本研究主要探討LncRNA AFAP1-AS1對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞的增殖、侵襲及凋亡的影響，為臨床治療提供新的目標(biāo)靶點(diǎn)。

Caspase-3是一種蛋白酶，1994年FERNANDES-ALNEMRI等[7]在表達(dá)序列標(biāo)記數(shù)據(jù)庫(kù)中找到一段與半胱氨酸蛋白酶抑制劑活性中心同源的序列，用它合成探針后篩選人Jurkat T淋巴細(xì)胞基因文庫(kù)，從中克隆出一種新基因，因其編碼相對(duì)分子質(zhì)量為 32 000 的半胱氨酸蛋白酶而稱之為CPP32，隨后這種蛋白酶被命名為Caspase-3[8]。Caspase是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的半胱氨酸蛋白酶，它們的一個(gè)重要共同點(diǎn)是活性位點(diǎn)都含有半胱氨酸，可特異地?cái)嚅_天冬氨酸殘基后的肽鍵[9-10]。本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了人絨毛膜癌細(xì)胞中凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組JEG-3細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9 mRNA表達(dá)均明顯高于空白對(duì)照組和空白載體組，提示LncRNA AFAP1-AS1對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞的凋亡具有促進(jìn)作用。另外，LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組JEG-3細(xì)胞中Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組和空白載體組，提示LncRNA AFAP1-AS1可以調(diào)控人絨毛膜癌細(xì)胞中凋亡因子蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而影響細(xì)胞凋亡。

本研究中，作者利用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)JEG-3細(xì)胞的增殖能力結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組細(xì)胞的增殖能力低于空白對(duì)照組和空白載體組，說明LncRNA AFAP1-AS1對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。而GUO等[11]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除胃癌細(xì)胞中的AFAP1-AS1相關(guān)基因，可以有效提高抑癌基因PTEN mRNA及蛋白的表達(dá)水平，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖，該研究也說明了AFAP1-AS1的表達(dá)可以通過多種信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞的增殖。本研究還發(fā)現(xiàn)，AFAP1-AS1過表達(dá)可以抑制JEG-3細(xì)胞的遷移能力。而ZHOU等[12]研究顯示，AFAP1-AS1高表達(dá)可促進(jìn)食管癌細(xì)胞的遷移，與本研究結(jié)果不一致。

本研究中流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對(duì)照組和空白載體組，說明LncRNA AFAP1-AS1對(duì)人絨毛膜癌細(xì)胞的過度凋亡具有明顯促進(jìn)作用。而LUO等[13]研究顯示，AFAP1-AS1表達(dá)上調(diào)可以減少腫瘤細(xì)胞凋亡，與本研究結(jié)果不一致。謝兵[14]研究發(fā)現(xiàn)，AFAP1-AS1表達(dá)可以抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，同時(shí)降低腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移概率，與本研究結(jié)果一致。

本研究證實(shí)了LncRNA AFAP1-AS1過表達(dá)可以抑制人絨毛膜癌細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但本研究只是初步研究了LncRNA AFAP1-AS1在人絨毛膜癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡中的作用，但其具體分子生物學(xué)機(jī)制尚未完全明了，需要進(jìn)一步研究探討。