小分子干擾RNA沉默果蠅zeste基因增強子同源物2對宮頸癌Hela細(xì)胞順鉑敏感性的影響

秦海霞，李少平，朱利紅，張全華，王世進(jìn)

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科 河南省神經(jīng)修復(fù)重點實驗室，河南 衛(wèi)輝 453100)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性生命健康[1]。順鉑是宮頸癌常用的一線化學(xué)治療藥物，但由于患者先天性或后天獲得性耐藥，使得部分患者無法完全獲益[2]，如何增強宮頸癌對順鉑的敏感性是臨床亟待解決的熱點及難點問題。果蠅zeste基因增強子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)為多梳基因(polycomb group gene,PcG)蛋白家族成員，其持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖與惡性轉(zhuǎn)化，被視為癌基因[3]。研究表明，沉默EZH2可提高非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌對順鉑的敏感性[4-5]。但沉默EZH2對宮頸癌順鉑敏感性的影響尚未可知。本研究利用小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)技術(shù)降低宮頸癌Hela細(xì)胞中EZH2表達(dá)，觀察EZH2表達(dá)變化對宮頸癌順鉑敏感性的影響，以期為宮頸癌分子靶向治療及化學(xué)治療的增敏治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞來源、主要試劑與儀器人宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞購于美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)、胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購于美國Gibco公司，四甲基偶氮唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]試劑盒、RNA提取試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司，Lipofectamine 2000脂質(zhì)體購于美國Invitrogen公司，EZH2單克隆抗體、β-actin單克隆抗體購于大連TaKaRa公司，細(xì)胞周期檢測試劑盒、流式細(xì)胞儀購于美國BD公司，EZH2 siRNA、control siRNA由廣州銳博科技有限公司構(gòu)建；全自動酶標(biāo)儀、超低溫冰箱、CL31R臺式冷凍離心機購于美國Thermo公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染復(fù)蘇Hela細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)1%雙抗和體積分?jǐn)?shù)10%FBS)懸浮細(xì)胞，于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板中，然后置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待貼壁細(xì)胞長滿底部面積80%～90%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將Hela細(xì)胞隨機分為空白對照組、control siRNA組和EZH2 siRNA組，每組3個復(fù)孔。Control siRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染control siRNA，EZH2 siRNA組細(xì)胞轉(zhuǎn)染EZH2 siRNA，空白對照組細(xì)胞不作處理；轉(zhuǎn)染操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后繼續(xù)恒溫培養(yǎng)6 h，更換培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞；轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)檢測3組Hela細(xì)胞中EZH2mRNA表達(dá)收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，采用TRIzol試劑盒分別提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄總RNA至cDNA，取1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實時熒光定量PCR，以β-actin為內(nèi)參。EZH2上游引物序列為5′-TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC-3′，下游引物序列為5′-TCCCTAGTCCCGCGCAATGAGC-3′；β-actin上游引物序列為5′-CATGTCGAGTTAAGGAGAAGC-3′，下游引物序列為5′-CTTTTAGTGGAGTGCCACA-GG-3′。實時熒光定量PCR反應(yīng)使用SYBR?Primix Ex TaqTM試劑盒，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。以β-actin管家基因作為內(nèi)參，在ABI 7900HT PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)采用二步法PCR擴增標(biāo)準(zhǔn)程序，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，4 ℃保存。每個反應(yīng)體系設(shè)置2個平行，每次循環(huán)的最后一步收集SYBR Green熒光，循環(huán)結(jié)束時從60 ℃開始做溶解曲線。采用2-△△Ct法獲得EZH2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.4Westernblot法檢測3組Hela細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞并提取細(xì)胞蛋白，定量蛋白濃度后行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜置于50 g·L-1脫脂奶粉封閉液4 ℃封閉4 h；含Tween-20的PBS洗滌3次，每次5 min；加入EZH2單克隆抗體(12 000)孵育過夜，含Tween-20的PBS洗滌3次，每次5 min；滴加二抗(1500)孵育4 h，含Tween-20的PBS洗滌3次，每次5 min；按電化學(xué)發(fā)光試劑盒說明書檢測EZH2蛋白表達(dá)；β-actin為內(nèi)參。

1.5碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色法檢測3組Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，每組2×105個細(xì)胞，PBS洗滌2次，每次3 min，1 mL 體積分?jǐn)?shù)70%乙醇固定，4 ℃保存過夜；PBS洗滌2次，每次3 min；加入500 μL PI 染色液，37 ℃避光孵育30 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

1.6MTT法檢測3組細(xì)胞對順鉑的敏感性收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，將細(xì)胞接種至96孔板，每孔1×104個細(xì)胞，加入100 μL培養(yǎng)液，將細(xì)胞置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；第2天，每孔加入順鉑，順鉑最終質(zhì)量濃度分別為0.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 g·L-1；繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后1 500 r·min-1離心5 min，棄上清液；每孔加入5 g·L-1MTT溶液20 μL，繼續(xù)于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；1 500 r·min-1離心5 min，棄上清液；每孔加入 100 μL 二甲基亞砜，震蕩至結(jié)晶物充分溶解；采用全自動酶標(biāo)儀測波長450 nm處吸光度值。計算各組細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果

2.1Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果結(jié)果見圖1。Control siRNA和EZH2 siRNA可高效轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率均達(dá)90%以上。

A：control siRNA組；B：EZH2 siRNA組。

圖1Hela細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果

Fig.1ResultsofHelacelltransfection

2.23組Hela細(xì)胞中EZH2mRNA表達(dá)比較空白對照組、control siRNA組和EZH2 siRNA組Hela細(xì)胞中EZH2 mRNA相對表達(dá)量分別為396.7±88.4、389.2±70.6和98.5±20.3，EZH2 siRNA組Hela細(xì)胞中EZH2 mRNA相對表達(dá)量顯著低于空白對照組和control siRNA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.057、2.015，P<0.01)；空白對照組與control siRNA組Hela細(xì)胞中EZH2 mRNA相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.476，P>0.05)。

2.33組Hela細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)比較結(jié)果見圖2?？瞻讓φ战M、control siRNA組和EZH2 siRNA組Hela細(xì)胞中EZH2 蛋白相對表達(dá)量分別為 509.4±110.7、497.5±80.4和120.4±31.3，EZH2 siRNA組Hela細(xì)胞中EZH2 蛋白相對表達(dá)量顯著低于空白對照組和control siRNA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.682、2.597，P<0.01)；空白對照組與control siRNA組Hela細(xì)胞中EZH2蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.943，P>0.05)。

圖23組Hela細(xì)胞中EZH2蛋白表達(dá)(Westernblot)

Fig.2ExpressionofEZH2proteininHelacellsofthethreegroups(Westernblot)

2.43組Hela細(xì)胞周期比較結(jié)果見圖3和表1。EZH2 siRNA組G0/G1期細(xì)胞比例顯著高于空白對照組和control siRNA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.893、3.087，P<0.05)；EZH2 siRNA組S期、G2/M期細(xì)胞比例顯著低于空白對照組和control siRNA組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(EZH2 siRNA組與空白對照組比較：t=2.526、5.462，P<0.05；EZH2 siRNA組與control siRNA組比較：t=2.498、5.417，P<0.05)。空白對照組與control siRNA組G0/G1期、S期及G2/M期細(xì)胞比例比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.926、1.017、0.947，P>0.05)。

A：空白對照組；B：control siRNA組；C：EZH2 siRNA組。

圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測3組Hela細(xì)胞周期

Fig.3Helacellcycleinthethreegroupsdetectedbyflowcytometry

表13組Hela細(xì)胞周期比較

組別細(xì)胞周期G0/G1/%S/%G2/M/%空白對照組52.6±5.714.9±3.233.0±5.3control siRNA組51.8±7.415.5±4.032.5±4.6EZH2 siRNA組82.9±6.3a5.5±3.8a5.2±2.2a

注：與空白對照組和control siRNA組比較aP<0.05。

2.53組Hela細(xì)胞的順鉑敏感性比較結(jié)果見圖4和表2。不同質(zhì)量濃度順鉑作用48 h后，同一質(zhì)量濃度下EZH2 siRNA組Hela細(xì)胞的存活率明顯低于空白對照組及control siRNA組(P<0.05)，且隨著順鉑濃度的增加，3組Hela細(xì)胞的存活率均呈逐漸下降趨勢。

圖43組Hela細(xì)胞存活率比較

Fig.4ComparisonofthesurvivalrateofHelacellsamongthethreegroups

表2不同質(zhì)量濃度順鉑作用下3組Hela細(xì)胞存活率比較

順鉑細(xì)胞存活率/%空白對照組control siRNA組EZH2 siRNA組0.0 g·L-1100.0±0.0100.0±0.0100.0±0.012.5 g·L-199.6±7.498.9±6.275.2±5.7a25.0 g·L-185.7±6.885.0±6.159.5±3.6a50.0 g·L-182.0±8.570.5±5.640.6±6.2a100.0 g·L-160.7±6.758.9±5.027.2±5.2a200.0 g·L-138.7±5.640.0±6.110.6±2.0a

注：與空白對照組和control siRNA組比較aP<0.05。

3 討論

宮頸癌起病隱匿，大多數(shù)患者確診時已為中晚期，失去了手術(shù)治療機會，臨床上常使用鉑類化學(xué)藥物治療，但患者的臨床受益率和癥狀緩解率仍不理想，其原因可能與鉑類藥物的原發(fā)性及繼發(fā)性耐藥有關(guān)[6-7]。因此，探討宮頸癌對鉑類藥物耐藥的機制是提高宮頸癌化學(xué)治療敏感性和改善臨床預(yù)后的關(guān)鍵。

表觀遺傳學(xué)改變在惡性腫瘤中很常見，是誘發(fā)腫瘤化學(xué)治療耐藥的重要基礎(chǔ)[8]。EZH2是新近發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳調(diào)控因子，定位于人染色體7q35，在進(jìn)化過程中高度保守，其作為PcG通路的核心組成部分，可發(fā)揮組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶作用，使PcG氨基發(fā)生三甲基化，招募多梳抑制復(fù)合物至特定基因位點，從而沉默與抑制細(xì)胞增殖相關(guān)的基因，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[9-11]。劉躍洋等[12]研究表明，宮頸癌組織中EZH2陽性表達(dá)率顯著高于宮頸上皮內(nèi)瘤變組織，且其表達(dá)與宮頸癌臨床分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及間質(zhì)浸潤深度密切相關(guān)，提示EZH2參與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。目前，EZH2對宮頸癌鉑類藥物耐藥性的影響及機制尚未明確。

ZHOU等[13]研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP、胃癌耐順鉑細(xì)胞株AGS/DDP中EZH2表達(dá)均顯著高于非耐藥細(xì)胞株，將EZH2 siRNA轉(zhuǎn)染至上述耐藥細(xì)胞，可顯著抑制細(xì)胞中EZH2表達(dá)，同時提高細(xì)胞對順鉑的敏感性，提示沉默EZH2表達(dá)可逆轉(zhuǎn)非小細(xì)胞肺癌及胃癌的順鉑耐藥性。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染EZH2 siRNA可顯著降低宮頸癌Hela細(xì)胞中EZH2 mRNA及蛋白表達(dá)，并增強順鉑對Hela細(xì)胞的抑制能力，提示沉默EZH2表達(dá)可提高宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。此外，通過檢測細(xì)胞周期變化發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染EZH2 siRNA可提高G0/G1期細(xì)胞比例，同時降低S期、G2/M期細(xì)胞比例，表明細(xì)胞周期發(fā)生了G1/S期阻滯。細(xì)胞周期阻滯是誘發(fā)細(xì)胞衰老的重要機制，而抵抗化學(xué)治療藥物所誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性的重要因素[14]。

INK4a/ARF/Rb基因是機體調(diào)控細(xì)胞衰老的重要信號通路，PcG對INK4a/ARF基因的沉默已被證實具有抑制細(xì)胞衰老及分化的作用[15-16]。鑒于EZH2在PcG通路的核心調(diào)控地位，故推測EZH2可抑制宮頸癌細(xì)胞衰老，而沉默EZH2表達(dá)可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，這可能是沉默EZH2表達(dá)后提高宮頸癌細(xì)胞順鉑敏感性的重要作用機制。

綜上所述，沉默EZH2表達(dá)可提高宮頸癌Hela細(xì)胞對順鉑的敏感性，而阻滯細(xì)胞周期可能是其主要作用機制。