企鵝巴氏桿菌分離鑒定及藥敏試驗

李浩然 劉曉涵 姜承源 褚家宏 王慧*

（臨沂大學農林科學學院動物醫(yī)學系276005）

巴氏桿菌?。≒asteurellosis)是由多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida)引起的多種動物和人的重要共患傳染病的總稱[1]。多殺性巴氏桿菌屬于巴氏桿菌科（Pasteurellaceae)的巴氏桿菌屬（Pasteurella)，是一種兩端鈍圓的短桿菌或球桿菌，不形成芽孢，無鞭毛，不運動，兼性厭氧，革蘭氏染色為陰性，瑞氏染色鏡檢菌體可見典型的兩級著色，該菌抵抗力一般，陽光直射或高溫可將其殺死，一般消毒劑在低濃度下也可將其殺死。

多殺性巴氏桿菌最早由Pasteur發(fā)現(xiàn)[2]，在2000年以前，我國關于家禽巴氏桿菌的發(fā)病報道較多見[3]，主要集中于家禽，但這之后的相關報道較少，而由企鵝源性的多殺性巴氏桿菌病感染引起的死亡病例更不常見，本試驗通過對企鵝多殺性巴氏桿菌的分離，對今后更好研究該病原奠定一定基礎，并通過藥敏試驗對相關疾病的臨床診斷和用藥治療提供參考。

1 試驗器材與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料來源

2018年4月臨沂市某水族館2只企鵝發(fā)病，其中1只死亡。臨床主要表現(xiàn)為發(fā)病企鵝體溫升高達43℃以上，一改往日的活躍現(xiàn)象，精神沉郁，羽毛凌亂，腹瀉情況嚴重，食欲減退或廢絕，行走緩慢無力，排灰綠色糞便，糞便中含少量血液。剖檢主要病理變化表現(xiàn)為皮下、呼吸道、消化道、腹腔黏膜和脂肪有出血點；心包增厚，內有大量淡黃色積液，心外膜有出血點；肝臟腫大，呈紫紅色，表面有灰白色針尖狀壞死點；十二指腸黏膜充血、出血，腸內容物中含有血液，黏膜紅腫。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

普通營養(yǎng)瓊脂（購自北京陸橋技術有限公司）、THB培養(yǎng)液（購自杭州天和微生物試劑有限公司）、半固體培養(yǎng)基（購自北京陸橋技術有限公司公司）、哥倫比亞培養(yǎng)基（購自杭州天和微生物試劑有限公司）、三糖鐵培養(yǎng)基（北京陸橋技術有限責任有限公司生產(chǎn)），巴氏桿菌生化常規(guī)微量鑒定管（購自浙江省軍區(qū)后勤部衛(wèi)生防疫檢疫檢驗所）、瑞氏染色液、革蘭氏染色液等。

1.1.3 藥敏試驗紙片

新生霉素、慶大霉素、氨芐西林、阿莫西林、青霉素、鏈霉素、氟苯尼考、環(huán)丙沙星、土霉素、呋喃唑酮等藥敏試紙片均由本實驗室制備。

1.1.4 試驗動物

試驗用7周齡健康小白鼠25只，購于臨沂市衛(wèi)生學校試驗動物養(yǎng)殖中心。

1.2 試驗儀器

手術刀；玻片；試管；酒精燈；鑷子；接種環(huán)；培養(yǎng)皿；1ml注射器；FA2004N電子天平（上海精密科學儀器有限公司制造2003年12月出廠）；5ml注射器；電熱鼓風干燥箱（山東龍口先科儀器公司制造2000年12月出廠）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；420型電熱恒溫培養(yǎng)箱（山東龍口先科儀器公司制造2000年12月出廠）；燒瓶；游標卡尺；恒溫水箱（HS-3001上海康華生化儀器制造廠）；高速臺式離心機（TGL-16G，上海安亭科學儀器廠）；超凈工作臺（SW-CJ-IF，蘇州安泰空氣技術公司制造2004年出廠）；SA300PL普通光學顯微鏡（北京泰克儀器有限公司生產(chǎn)；2001年生產(chǎn)）。

2 試驗方法

2.1 病原菌分離鑒定

2.1.1 各種培養(yǎng)基的制備

按規(guī)格分別配制普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血清半固體培養(yǎng)基、THB固體培養(yǎng)基（加入1.5%瓊脂粉）、THB液體培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基按常規(guī)進行配制。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基121℃滅菌30min，THB培養(yǎng)基與哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基121℃滅菌15min，倒入平板和試管，4℃放置備用。

2.1.2 病料涂片染色

取病死企鵝肝臟、心血、脾臟及純培養(yǎng)物涂片，干燥，革蘭氏染色。將抹片置于空氣中自然干燥；火焰固定，將已干燥的抹片菌膜向上，在火焰上緩緩來回通過3次（用手背觸及抹片反面，以不燙手為宜）。染色， （1）初染，在固定的抹片上，滴加草酸銨結晶紫染色液染色1～2min，水洗。 （2）媒染，再加革蘭氏碘溶液于抺片上，助染1～2min，水洗。 （3）脫色，用95%酒精滴于載玻片上脫色約30s。應將玻片不時搖動，至無色素脫下為止，水洗。 （4）復染，用沙黃染液復染1min，水洗。 （5）吸干或自然干燥。鏡檢觀察；瑞氏染色：抹片固定好后，按涂抹點大小，蓋上一塊略大的清潔濾紙片，在其上輕輕滴加瑞氏染色液，至略浸過濾紙，并看情況補滴，維持不使變干；染色3min后，滴加與染液等量的中性蒸餾水，輕輕晃動玻片，使與染液混勻，經(jīng)3min，除去濾紙片，直接用水沖洗，吸干或烘干，鏡檢[4]。

2.1.3 分離培養(yǎng)與觀察

在無菌條件下，將肝、脾等病料接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、三糖鐵培養(yǎng)基觀察其生長情況，37℃培養(yǎng)24h后觀察細菌生長情況，并挑取單菌落無菌劃線接種于THB固體培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，另挑取單菌落接種于THB液體培養(yǎng)基中，置于搖床，37℃培養(yǎng)24h，觀察細菌生長情況。

2.1.4 運動性觀察

將分離的細菌接種到THB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18～24h，挑取單個菌落穿刺血清半固體培養(yǎng)基，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察其生長情況。

2.1.5 生化試驗

用滅菌的接種針取血液瓊脂平板培養(yǎng)物接種于生化常規(guī)微量鑒定管，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，觀察其生長發(fā)酵情況。

2.2 動物試驗

取小白鼠30只，10只/組，2組試驗組（高劑量/低劑量），1組對照組。高劑量試驗組每只小鼠皮下注射THB液體培養(yǎng)基菌液0.3ml，低劑量試驗組每只小鼠皮下注射THB液體培養(yǎng)基菌液0.1ml，對照組每只小鼠皮下注射生理鹽水0.1ml，觀察小鼠死亡情況。

2.3 藥敏試驗

本試驗采用藥物紙片瓊脂擴散法。藥敏試紙選用濾紙，用打孔器打成直徑6mm的圓片，經(jīng)121℃15min高壓滅菌后，于60℃下烘干備用。將濾紙片浸泡于配好的藥液中，2h后取出，烘干，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.1 菌液的配制

在超凈工作臺上，用接種環(huán)在酒精燈旁無菌挑取巴氏桿菌菌落1～2個，分別與3ml滅菌去離子水生理鹽水充分混合制成巴氏桿菌懸液。

2.3.2 菌液的涂布與藥敏紙片的放置

吸取THB液體培養(yǎng)基菌液，與生理鹽水1∶1混合，配制200μl混合菌液，無菌涂布于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基中，室溫靜置2～3min，用鑷子小心夾取藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)12h后觀察結果。

2.3.3 藥敏試驗判定標準

培養(yǎng)24h后取出培養(yǎng)基，測量抑菌圈的直徑大小。抑菌圈的邊緣以肉眼看不到菌菌落明顯生長為限。按照抑菌圈直徑的大小判斷菌株對藥物的敏感性。一般抑菌直徑＜10mm為耐藥；抑菌直徑10～15mm為低度敏感；抑菌直徑15～20mm為中敏；抑菌直徑≥20mm為高敏[8]。

3 試驗結果及分析

3.1 涂片染色結果

組織觸片或培養(yǎng)物涂片，革蘭氏染色、觀察，鏡檢，發(fā)現(xiàn)密集的兩極濃染、革蘭氏染色陰性的短桿菌，疑為巴氏桿菌；瑞氏染色鏡檢，可見兩極濃染卵圓小桿菌。符合多殺性巴氏桿菌的形態(tài)特征。

3.2 細菌分離培養(yǎng)結果

在THB培養(yǎng)基上可見約2～3mm的光滑、隆起、灰白色、半透明、露珠樣不溶血的小菌落；在麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上無明顯菌落生長；三糖鐵培斜面養(yǎng)基的斜面和底面都變黃，產(chǎn)氣。從平板上挑起涂片，革蘭氏染色，鏡檢革蘭氏陰性，可見兩端鈍圓、兩極濃染的橢圓形小桿菌，疑為巴氏桿菌。

3.3 運動性觀察結果

一種菌在半固體血清培養(yǎng)基中細菌沿穿刺線生長說明，該菌無運動力，疑為巴氏桿菌。

3.4 生化試驗結果

結果見表1可以看出，其符合巴氏桿菌特征。

表1 疑為巴氏桿菌生化反應結果

3.5 動物接種試驗結果

接種后第12小時，試驗組小鼠出現(xiàn)明顯的精神沉郁等癥狀，對照組小鼠無明顯變化。高劑量試驗組小鼠接種后18h內全部死亡；低劑量試驗組小鼠接種后24h內全部死亡，對照組小鼠健康存活。將致死小鼠逐一解剖，可見典型敗血癥癥狀，特別在皮下及肝、脾等臟器有明顯出血點，對照組小鼠無明顯出血癥狀。取致死小鼠肝、脾及血液涂片并用姬姆薩-瑞氏染色，均可見兩極著色的短小桿菌。

3.6 藥敏試驗結果

從表2可以看出，分離菌巴氏桿菌對氟苯尼考、環(huán)丙沙星、氨芐西林等高敏；新霉素、呋喃唑酮、慶大霉素等中敏；青霉素、鏈霉素等低敏；對阿莫西林、土霉素等耐藥。

表2 巴氏桿菌對藥物的敏感情況（mm）

4 討論

（1）隨著抗菌藥物的廣泛應用和疾病治療中超量不當使用抗生素，細菌極易對一種甚至多種抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，并且到了難以控制的地步。出現(xiàn)了多重耐藥菌株且耐藥菌株廣泛傳播的局面。該水族館出現(xiàn)該疾病后，曾用多種常用抗生素（如阿莫西林）治療，但療效甚微。試驗結果也表明，分離出的病原菌對臨床常用藥物如鏈霉素等均表現(xiàn)出高度耐藥性，且已嚴重影響到治療效果和經(jīng)濟效益，為臨床上治療巴氏桿菌病帶來很大困難。因此，切勿濫用抗生素，并且有必要在使用抗生素前最好先進行藥敏試驗，篩選出敏感抗生素，按該藥的常規(guī)劑量和療程使用[16]，為了防止耐藥菌株的產(chǎn)生，臨床上應交替使用敏感抗菌藥物。

（2）多殺性巴氏桿菌廣泛存在于自然界中。該水族館企鵝發(fā)病，可能由于飼養(yǎng)管理不當，場所及飲食方面等多方綜合原因引起。故在飼養(yǎng)管理時，應加強飼養(yǎng)環(huán)境消毒，尤其對飼養(yǎng)用具，徹底消毒，殺滅病原微物，減少感染疾病的途徑，對企鵝活動的區(qū)域的護欄等設施認真修整，防止尖刺和鐵絲尖刺傷企鵝。

（3）目前我國出現(xiàn)的多殺性巴氏桿菌感染多為禽源，以禽霍亂為主，由于我國不是企鵝的主要飼養(yǎng)國家，主要針對特定場所用于觀賞，所以全國企鵝源性的巴氏桿菌報道幾乎沒有，當前，防治該病主要困難為抗生素濫用現(xiàn)象日益嚴重及飼養(yǎng)環(huán)境逐漸惡化，所以，加強平時飼養(yǎng)管理是防治本病的重中之重，加強平時管理要注意市場通風、定期消毒、適時擴群。加強免疫，針對禽霍亂，除特定疫苗外還可以使用蜂膠苗，在產(chǎn)蛋前1～2周使用，并配以抗生素的使用，本文通過藥敏試驗可以發(fā)現(xiàn)，分離自企鵝體內的多殺性巴氏桿菌對氟苯尼考、環(huán)丙沙星、氨芐西林等高敏；新霉素、呋喃唑酮、慶大霉素等中敏；青霉素、鏈霉素等低敏；對阿莫西林、土霉素等耐藥。因此，除加強管理，及時免疫外，還要根據(jù)藥敏試驗指導，合理使用抗生素，切勿濫用抗生素，可有效防治本病的發(fā)生。