非小細胞肺癌細胞中上皮特異性黏附分子的表達及其對細胞增殖和侵襲能力的影響

劉春華，王俊軼，銀 春，張 艷，姜 琪

1)四川綿陽四〇四醫(yī)院呼吸內(nèi)科 四川綿陽 621000 2)成都市第三人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科 成都 610031

肺癌是常見的肺部惡性腫瘤，根據(jù)組織病理學(xué)特性將其分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC占80%～85%。近年來，肺癌在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率一直呈上升趨勢，嚴重威脅人類的健康[1-2]。上皮特異性黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)屬于黏附分子家族的單次跨膜糖蛋白，在大腸癌、前列腺癌和胃癌等多種人類腫瘤組織中異常表達，通過調(diào)控相關(guān)信號通路或靶基因參與腫瘤細胞的增殖、分化、黏附、侵襲和遷移等過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[3-5]。有研究[6-7]指出，高表達EpCAM與肺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良關(guān)系密切，其可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。目前，EpCAM在NSCLC中的作用尚不清楚，本研究通過觀察EpCAM在3種NSCLC細胞株H226、A549和PC-9中的表達，并構(gòu)建EpCAM低表達的A549細胞，從細胞水平上探討EpCAM對NSCLC細胞增殖及侵襲的影響，以期為NSCLC的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1材料正常支氣管上皮BEAS-2B細胞、肺鱗癌H226細胞、肺腺癌A549細胞、肺腺癌PC-9細胞均購于中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購于美國Gibco公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本TaKaRa公司，青/鏈霉素、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒和CCK-8細胞活力檢測試劑盒購于上海碧云天公司，脫脂奶粉購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司， ECL超敏發(fā)光液購于北京普利萊基因技術(shù)有限公司。EpCAM抗體、β-actin抗體、Ki-67抗體、MMP-9抗體和HRP-羊抗兔/鼠IgG購自美國Santa Cruz公司。EpCAM shRNA慢病毒顆粒和對照shRNA慢病毒顆粒購于美國Santa Cruz公司。qRT-PCR試劑盒購于美國MBI Fermentas公司，PCR引物購于上海吉瑪生物公司。Transwell小室、PVDF膜購于美國Millpore公司，Matrigel膠購于美國BD公司。Multiskan FC酶標(biāo)儀購于美國Thermo Scientific公司，轉(zhuǎn)印電泳儀、多功能凝膠成像系統(tǒng)購于美國Bio-Rad公司，分光光度計購于北京凱奧公司。

1.2細胞培養(yǎng)采用含有體積分數(shù)10%胎牛血清、100 g/L鏈霉素和100 U/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基接種BEAS-2B細胞和NSCLC細胞H226、A549、PC-9，置于體積分數(shù)5%CO2、37 ℃恒溫的細胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。經(jīng)換液(每3 d一次)和傳代(每周2次)后，收集對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.3BEAS-2B、H226、A549和PC-9細胞EpCAMmRNA表達的檢測采用qRT-PCR法進行檢測。取收集到的對數(shù)生長期BEAS-2B、H226、A549和PC-9細胞，加入Trizol試劑提取總蛋白，分光光度計對所提總蛋白進行濃度和純度的檢測。EpCAM上游引物5’-TGCTCTGAGCGAGTGAGAA-3’，下游引物5’-TGCAGTCCGCAAACTTTTA-3’； 內(nèi)參β-actin上游引物5’-GGACCTGACTGACTACCTC-3’，下游引物5’-TACTCCTGCTTGCTGAT-3’。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。取2 μL cDNA，加入10 μL Mix、各1 μL上下游引物和6 μL ddH2O 配制反應(yīng)體系。經(jīng)離心將20 μL反應(yīng)體系混勻后，放入PCR儀中，設(shè)置PCR擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(40個循環(huán))；72 ℃ 8 min。采用2-ΔΔCt法計算EpCAM mRNA相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.4BEAS-2B、H226、A549和PC-9細胞EpCAM蛋白表達的檢測采用Western blot法進行檢測。收集對數(shù)生長期的BEAS-2B、H226、A549和PC-9細胞，分別根據(jù)總蛋白提取試劑盒和BCA蛋白濃度測定試劑盒提取和檢測總蛋白。取總蛋白50 g，加入4×蛋白上樣緩沖液混合后于沸水浴中5 min變性，行120 g/L SDS-PAGE凝膠電泳。上樣后先以90 V電泳30 min，改換120 V電泳90 min結(jié)束分離總蛋白，再以30 V電壓轉(zhuǎn)膜90 min。將含有蛋白的PVDF膜浸泡于50 g/L脫脂奶粉封閉液2 h。加入EpCAM抗體(1∶200)和β-actin抗體(1∶1 000)，于4 ℃條件下反應(yīng)24 h。經(jīng)TBST漂洗后，加入HRP-羊抗兔/鼠IgG二抗(1∶6 000)，常溫反應(yīng)1 h。以ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用Image J軟件分析EpCAM 蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

1.5A549細胞轉(zhuǎn)染效果評價取24孔細胞板，以每孔3.5×105個細胞接種，將A549細胞分為對照組、陰性對照組和EpCAM干擾組。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞融合度達80%左右時，進行慢病毒感染。分別向EpCAM干擾組和陰性對照組培養(yǎng)液中加入EpCAM shRNA和對照shRNA慢病毒懸液，對照組中加入等體積培養(yǎng)液。充分混勻后，孵育24 h。以1 mL完全培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液后，孵育24 h。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，以2 mg/L嘌呤霉素重懸細胞，以適當(dāng)濃度種植于96孔板上，每3 d更換培養(yǎng)液(含嘌呤霉素)，確認克隆形成后，篩選幾個克隆，參照1.3和1.4中的方法檢測各組細胞中EpCAM mRNA和蛋白的表達情況，以評價其轉(zhuǎn)染效果。

1.6A549細胞增殖能力檢測采用CCK-8法進行檢測。收集對數(shù)生長期的A549細胞，以每孔200 μL(細胞密度為3×104個/mL)種植到96孔板上。于培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按照1.5中方法進行轉(zhuǎn)染。每組各設(shè)5個平行孔，實驗重復(fù)3次。按照實驗要求培養(yǎng)24、48和72 h后，加入CCK-8溶液20 μL，反應(yīng)2.5 h后，采用酶標(biāo)儀檢測各組細胞在570 nm處的光密度(OD)值。

1.7A549細胞克隆形成能力檢測采用細胞平板克隆實驗進行檢測。取對數(shù)生長期的A549細胞，按照1.5中的分組處理細胞后，以胰蛋白酶消化制備密度為3×104個/mL的細胞懸液，以每皿5 mL接種至培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)條件培養(yǎng)10 d(形成肉眼可見細胞集落)。棄上清后，以磷酸緩沖液洗滌細胞。采用體積分數(shù)為10%甲醇固定，質(zhì)量分數(shù)為0.1%結(jié)晶紫染色，各30 min。沖洗染色液后，晾干。在顯微鏡低倍鏡下選取5個視野，觀察并計數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.8A549細胞侵襲能力檢測采用Transwell小室進行檢測。將對照組、陰性對照組和EpCAM 干擾組A549細胞以無血清培養(yǎng)基配制成密度為3×104個/mL的細胞懸液。取Transwell小室，以50 μL Matrigel溶液包被聚碳酸酯微孔膜，常溫下聚合30 min。下室中每孔加入100 μL含血清的完全培養(yǎng)基，收集各組細胞，按照每室100 μL加入上室，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)30 h。以棉簽小心擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細胞，常溫下甲醛固定，結(jié)晶紫染色，各15 min。顯微鏡下選取5個200倍視野，統(tǒng)計穿過濾膜的細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.9A549細胞中Ki-67和MMP-9蛋白表達的檢測采用Western blot法進行檢測。收集對照組、陰性對照組和EpCAM干擾組A549細胞，經(jīng)提取總蛋白、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，加入特異性一抗Ki-67抗體(1∶800)、MMP-9抗體(1∶500)和β-actin抗體(1∶1 000)，反應(yīng)過夜后，再加入二抗。顯影曝光后，凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用Image J軟件進行分析。實驗重復(fù)3次。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計學(xué)處理。BEAS-2B細胞及3種NSCLC細胞間EpCAM蛋白和mRNA相對表達量的比較，對照組、陰性對照組和EpCAM干擾組間EpCAM mRNA、EpCAM蛋白、Ki-67蛋白、MMP-9蛋白相對表達量以及OD值、細胞克隆數(shù)、侵襲細胞數(shù)的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1EpCAM在BEAS-2B細胞及3種NSCLC細胞中的表達及其在A549細胞中的干擾效果結(jié)果見圖1和表1。與正常支氣管上皮BEAS-2B細胞相比，A549、H226和PC-9細胞中EpCAM蛋白和mRNA表達均升高，并且3種NSCLC細胞中EpCAM蛋白和mRNA的表達水平依次為A549>PC-9>H226。因此，選用A549細胞開展后期實驗。對照組、陰性對照組和EpCAM干擾組中EpCAM mRNA的相對表達量分別為(1.00±0.12)、(1.02±0.08)和(0.21±0.02)(F=90.609，P<0.001)；EpCAM 蛋白的相對表達量分別為(0.62±0.07)、(0.54±0.05)和(0.10±0.01)(F=94.080，P<0.001)。與對照組相比，陰性對照組中EpCAM mRNA和蛋白的相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但EpCAM干擾組中EpCAM mRNA和蛋白的相對表達量均降低(P<0.05)。

圖1 EpCAM在BEAS-2B細胞、3種NSCLC細胞中的表達(A)及其在A549細胞中的干擾效果(B)

*：與BEAS-2B細胞相比，P<0.05；#：與H266細胞相比，P<0.05；△：與PC-9細胞相比，P<0.05

2.2干擾EpCAM表達對A549細胞增殖的影響結(jié)果見表2。與對照組相比，陰性對照組A549細胞OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義；EpCAM干擾組A549細胞OD值與對照組相比均降低。

表2 各組A549細胞OD值比較(n=3)

*：與其他2組相比，P<0.05

2.3干擾EpCAM表達對A549細胞克隆形成和侵襲能力的影響結(jié)果見表3。與對照組相比，陰性對照組中細胞克隆數(shù)和侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，干擾EpCAM表達能夠減少細胞克隆數(shù)和侵襲細胞數(shù)。

表3 各組A549細胞克隆數(shù)和侵襲細胞數(shù)的比較(n=3)

*：與其他2組相比，P<0.05

2.4干擾EpCAM表達對A549細胞中Ki-67和MMP-9蛋白表達的影響結(jié)果見圖2和表4。陰性對照組Ki-67和MMP-9蛋白的表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而EpCAM干擾組兩種蛋白的表達水平均降低。

圖2 各組A549細胞中Ki-67和MMP-9蛋白表達的檢測結(jié)果

組別Ki-67MMP-9對照組0.78±0.050.59±0.03陰性對照組0.82±0.040.62±0.05EpCAM干擾組0.34±0.02*0.38±0.02*F141.86740.500P<0.001<0.001

*：與其他2組相比，P<0.05

3 討論

EpCAM基因廣泛存在于人上皮組織中，其蛋白是由腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)1基因編碼的相對分子質(zhì)量為40 000的單次跨膜蛋白，它由單次跨膜區(qū)、胞外結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域組成，其中胞內(nèi)部分氨基酸可將信號傳遞到胞核，發(fā)揮調(diào)控下游基因的作用，進而參與細胞間黏附、增殖、分化和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。大量研究[8-10]指出，EpCAM在上皮性卵巢癌和乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達，與腫瘤的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度等關(guān)系密切。在結(jié)腸癌中，利用siRNA沉默EpCAM基因，可明顯降低細胞或干細胞的增殖和侵襲能力，同時增強其對伊立替康、卡培他濱藥物的敏感性[11-12]。同時，在體內(nèi)上皮癌小鼠模型和體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中下調(diào)EpCAM的表達，能夠減弱細胞增殖[13]。有研究[7]指出，高表達EpCAM與肺癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，但其在NSCLC中的作用尚不清楚。本研究采用qRT-PCR和Western blot觀察EpCAM在H226、A549和PC-9細胞株中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常支氣管上皮BEAS-2B細胞相比，3種NSCLC細胞中EpCAM蛋白和mRNA表達水平均明顯升高，且腺癌細胞中的表達水平高于鱗癌細胞。提示，EpCAM在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。成功干擾A549細胞中EpCAM的表達后，采用CCK-8和平板克隆實驗進行檢測后發(fā)現(xiàn)，細胞的增殖、克隆形成能力均明顯減弱；同時，采用Transwell小室檢測細胞的侵襲能力，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)細胞的侵襲能力受到抑制?？梢姡蓴_EpCAM的表達可抑制A549細胞的增殖和侵襲，這與Zhou等[8]的研究結(jié)果相吻合。

腫瘤細胞的無限增殖和侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要機制。Ki-67是一種增殖細胞相關(guān)的核抗原，可作為檢測腫瘤細胞增殖能力的可靠指標(biāo)；腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是基底膜和細胞外基質(zhì)的降解，而在降解細胞外基質(zhì)過程中發(fā)揮重要作用的唯一酶類是MMP；MMP-9可通過降解Ⅳ型膠原破壞腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的組織學(xué)屏障，從而引發(fā)惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Ki-67和MMP-9表達與NSCLC患者病理類型、腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有著密切關(guān)系[14-15]。在胃癌細胞中，EpCAM與Ki-67表達呈正相關(guān)，EpCAM表達水平越高，胃癌細胞增殖能力越強[16]；乳腺癌細胞中，敲除EpCAM基因可通過抑制Ras/Raf/ERK信號通路和MMP-9表達抑制癌細胞的增殖和侵襲[17]。為了探討干擾EpCAM表達抑制A549細胞增殖和侵襲的分子機制，本研究采用Western blot檢測抑制EpCAM表達后A549細胞中Ki-67和MMP-9蛋白的表達情況，結(jié)果顯示兩種蛋白的表達水平較對照組均明顯降低。提示，干擾EpCAM的表達可能通過降低Ki-67和MMP-9的表達抑制A549細胞的增殖和侵襲。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)EpCAM在NSCLC細胞中高表達，且腺癌中的表達水平高于鱗癌，提示EpCAM在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。干擾EpCAM的表達可抑制A549細胞的增殖和侵襲，其分子機制可能與抑制Ki-67和MMP-9的表達有關(guān)。這一結(jié)果為NSCLC的診斷和治療提供了新的線索和依據(jù)。