人腦星形細(xì)胞瘤組織HPA的表達(dá)及對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的影響

張君娜

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，河南 開封475000)

星形細(xì)胞瘤是常見的腦腫瘤，有資料[1]顯示其約占腦腫瘤的45%左右，并且近年來其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)。星形細(xì)胞瘤患者采用手術(shù)治療難以根治，預(yù)后普遍較差，這不僅與腫瘤的組織學(xué)類型有關(guān)，還有腫瘤細(xì)胞的侵襲增殖能力相關(guān)[2]。因此如何阻止腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是治療星形細(xì)胞瘤的熱門研究方向。乙酰肝素酶（HPA）是一類內(nèi)切糖苷酶，能夠?qū)⒓?xì)胞外基質(zhì)的組織屏障破壞，使其他物質(zhì)進(jìn)入基質(zhì)。有研究[3]顯示，多類惡性腫瘤的患者存在體內(nèi)HPA異常表達(dá)的現(xiàn)象，在腫瘤細(xì)胞的侵襲過程中起到重要作用。故在本次試驗(yàn)中，觀察HPA在星形細(xì)胞瘤患者體內(nèi)的表達(dá)情況，并研究其對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 樣本來源 選取2013年3月-2017年3月期間在我院行手術(shù)切除的67例腦星形細(xì)胞瘤患者的病理切片標(biāo)本，切片標(biāo)本均經(jīng)2位病理科副高醫(yī)師按WHO的《神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤》[4]復(fù)查審核，將其設(shè)為腫瘤組。腫瘤組：男37例，女30例，年齡26~73 歲，平均年齡（58.23±12.51）歲，病理分型：Ⅱ級(jí)21例，Ⅲ級(jí)27例，Ⅳ級(jí)19例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合星形細(xì)胞瘤的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡＞18歲；③患者未接受過放化療；④研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有精神疾病史；②有其他顱內(nèi)疾病的。選擇同時(shí)期39例因腦外傷在我院行顱內(nèi)減壓術(shù)的患者的正常腦組織，制作切片，設(shè)為正常對(duì)照組。正常對(duì)照組：男24例，女15例，年齡24~69歲，平均年齡（47.12±10.47）歲。

1.2 儀器與試劑 主要試劑：兔抗人HPA多克隆抗體（BA1630），購于武漢博士德生物工程有限公司。即用型非生物素免疫組化EliVisionTM plus試劑盒、DAB顯色試劑盒、檸檬酸鹽緩沖液，購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。10%胎牛血清，購于杭州四季青生物有限公司。DMEM培養(yǎng)基，購于GIBCO公司。HPA一抗，購于Santa Crus公司。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG購于KPL公司。siRNA購于Dharmacon公司。人工基底膜基質(zhì)凝膠(matrigel)購自美國BD公司。Trizol試劑盒和質(zhì)粒購于Invitrogen公司。星形細(xì)胞瘤U87細(xì)胞，購于上海北諾生物科技有限公司。Transwell小室購于Costar公司。

主要儀器：切片機(jī)，購于Microm公司。光學(xué)顯微鏡，購于鎮(zhèn)江新天醫(yī)療有限公司。PCR擴(kuò)增儀購于湖南赫西儀器裝備有限公司。倒置顯微鏡，購于重慶化學(xué)試劑玻璃儀器總公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 免疫組化染色 每例研究對(duì)象的腦組織用10%中性甲醛固定后，用石蠟包埋，然后連續(xù)切片（厚度為 4μm），60℃干燥 40min，脫蠟，然后加檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，98℃15min，自然冷卻。再用PBS緩沖液沖洗3次，加DAB液，沖洗后蘇木素染色封片，用已知陽性切片做陽性對(duì)照，用PBS液代替一抗做陰性對(duì)照。鏡下觀察：胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒即為HPA陽性；每個(gè)切片取5個(gè)視野，每個(gè)視野下計(jì)算100個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽性細(xì)胞所占的比例，并進(jìn)行計(jì)分：細(xì)胞數(shù)＜10%為0分，10%~50%為1分，51%~75%為2分，＞75%為3分。然后根據(jù)染色程度進(jìn)行計(jì)分：未著色為0分，著色淺為1分，黃色為2分，深棕色為3分。陽性占比×染色程度＞1分為+，＞3分為++，＞6分為+++。 +及+以上即為陽性表達(dá)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選擇星形細(xì)胞瘤U87細(xì)胞系分3組進(jìn)行培養(yǎng)：將細(xì)胞置于含10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml，分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組。細(xì)胞融合至50%，24h后開始轉(zhuǎn)染，陰性對(duì)照組加入空質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染組加入HPA siRNA。

1.3.3 PCR技術(shù)檢測HPA mRNA的表達(dá) 采用RT-PCR法檢測，按1.3.2中培養(yǎng)所得的細(xì)胞以及1.3.1中研究對(duì)象的腦組織取組織約152400mg，轉(zhuǎn)移到勻漿管中，加入1ml Trizol，用勻漿器研磨3min，然后加入氯仿 200μl，混勻 30s，靜置 10min；轉(zhuǎn)移到1.5ml DEPC處理的無菌離心管中，混勻，離心（12000rpm，15min）；取上層清液至另一離心管中，加入等容積異丙醇，混勻，靜置10min，再次離心（12000rpm，15min）；吸除上清液，加入 700μl 75%乙醇，懸浮沉淀，再次離心（12000rpm，10min）；吸除上清液，用移液器吸干殘余酒精，室溫空氣干燥；加入20ttl DEPC處理的滅菌水，溶解RNA；然后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，設(shè)計(jì)引物：HPA：5’-GAATGGACGGACTGCTAC-3’ （ 上 游 ）、5’ -CCAAAGAATACTTGCCTCA-3’（下游），擴(kuò)增產(chǎn)物138bp；內(nèi)參β-actin：5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3’（上游 ）、5’-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3’（下游）， 擴(kuò)增產(chǎn)物180bp； 反應(yīng)條件：95℃ 1min，95℃15s，50℃ 1min，72℃ 20s，循環(huán) 40 次，測得 Ct值，計(jì)算出HAP mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn) 將mareigel膠用不完全DMEM培養(yǎng)基按1：5稀釋，取50μl在Transwell上室制作人工基底膜，將1.3.2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞制成密度為3×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液取100μl，加入Transwell上室，取600μl的10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基加入到下室，37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)18h，吸除培養(yǎng)基，PBS緩沖液沖洗，室溫下用甲醛固定30min，干燥過夜，取下微孔膜，在倒置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)穿過微孔的細(xì)胞數(shù)即為侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 Transwell細(xì)胞遷移試驗(yàn) 不用matrigel膠制作基底膜，選用1.3.2轉(zhuǎn)染所得的細(xì)胞，按1.3.4操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HPA表達(dá)情況的比較 正常對(duì)照組患者腦組織中未出現(xiàn)HPA表達(dá)，腫瘤組中有53例患者陽性表達(dá)，且HPA mRNA表達(dá)量高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 1、圖 1。

表1 兩組HPA表達(dá)情況的比較（，%）

表1 兩組HPA表達(dá)情況的比較（，%）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05。

1.87±0.36*組別正常對(duì)照組腫瘤組例數(shù) HPA陽性率%（n） HPA mRNA表達(dá)量39 67 0 0 77.61（52）*

圖1 HPA在星形細(xì)胞瘤U87細(xì)胞中的表達(dá)（×100）

2.2 不同分型組織中HPA的表達(dá)情況 隨著腫瘤組織惡性程度的升高，HPA陽性表達(dá)率和HPA mRNA表達(dá)量也明顯升高，其中Ⅲ、Ⅳ級(jí)腫瘤組織中HPA陽性表達(dá)率和HPA mRNA表達(dá)量高于Ⅱ級(jí)，Ⅳ級(jí)腫瘤組織中HPA mRNA表達(dá)量高于Ⅲ級(jí)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Ⅳ級(jí)腫瘤組織中HPA陽性率高于Ⅲ級(jí)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 2。

2.3 HPA在有無轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)情況 發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中HPA陽性率為94.17%，高于未轉(zhuǎn)移的55.17%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表2 不同分型腫瘤組織中HPA的表達(dá)情況（，%）

表2 不同分型腫瘤組織中HPA的表達(dá)情況（，%）

注：與Ⅱ級(jí)比較，*P＜0.05，與Ⅲ級(jí)比較，#P＜0.05。

1.05±0.44 1.37±0.35*1.92±0.26*#分型Ⅱ級(jí)Ⅲ級(jí)Ⅳ級(jí)例數(shù) HPA陽性率%（n） HPA mRNA表達(dá)量21 27 19 57.14（12）81.48（25）*94.74（18）*

表3 HPA在有無轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)情況（%）

2.4 siRNA沉默HPA基因表達(dá)對(duì)U87細(xì)胞侵襲、遷移的影響 Transwell試驗(yàn)顯示：空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組之間，侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)無明顯差異（P＞0.05）；轉(zhuǎn)染組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)顯著低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），見表 4、圖 2、圖 3。

表4 siRNA沉默HPA基因表達(dá)對(duì)U87細(xì)胞侵襲、遷移的影響（）

表4 siRNA沉默HPA基因表達(dá)對(duì)U87細(xì)胞侵襲、遷移的影響（）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，與陰性對(duì)照組比較，#P＜0.05。

65±11 63±10 22±4*#組別空白對(duì)照組陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染組侵襲細(xì)胞數(shù) 遷移細(xì)胞數(shù)86±15 82±12 21±4*#

圖2 三組細(xì)胞侵襲能力的比較（×100）

圖3 三組細(xì)胞遷移能力的比較（×100）

3 討論

星形細(xì)胞瘤是最常見的腦內(nèi)腫瘤，起源于胚胎外胚層[5]，由于預(yù)后差，嚴(yán)重威脅了患者的生命健康。通過手術(shù)治療難以根治，星形細(xì)胞瘤預(yù)后差的原因是無論分化程度的高低，腫瘤細(xì)胞都出現(xiàn)浸潤性生長[6]。腫瘤的浸潤性生長是通過破壞細(xì)胞外基質(zhì)[7]，穿過其與血管基底膜形成的天然屏障來實(shí)現(xiàn)。

HPA是一類細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，正常情況下主要儲(chǔ)存于淋巴結(jié)、脾臟和胸腺等免疫組織中，在非免疫組織中不表達(dá)，但是近年來大量研究[8，9]顯示其卵巢癌、乳腺癌、胃癌等多種癌癥組織內(nèi)異常高表達(dá)。HPA的作用機(jī)制是通過特異性鏈接硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）上的硫酸肝素，將其裂解，從而導(dǎo)致：①細(xì)胞外基質(zhì)被降解，天然屏障被破壞，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)[10]；②將堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）釋放出來，bFGF是活性較強(qiáng)的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的生長因子[11]，平時(shí)儲(chǔ)存于細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)，基質(zhì)被破壞后，bFGF大量釋放，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，使新生血管形成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；③纖溶酶原（PA）被HPA釋放，活化生長因子[12]，為腫瘤細(xì)胞的增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

正常對(duì)照組患者腦組織中未出現(xiàn)HPA表達(dá)，腫瘤組中有53例患者陽性表達(dá)，且HPA mRNA表達(dá)量高于正常對(duì)照組（P＜0.05），與劉宏雷[13]的研究結(jié)果一致，這說明HPA在星形細(xì)胞瘤患者組織中異常表達(dá)，其為何在正常組織內(nèi)不表達(dá)的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究探尋。而且隨著腫瘤組織惡性程度的升高，HPA陽性表達(dá)率和HPA mRNA表達(dá)量也明顯升高，其中Ⅲ、Ⅳ級(jí)腫瘤組織中HPA陽性表達(dá)率和HPA mRNA表達(dá)量高于Ⅱ級(jí)，Ⅳ級(jí)腫瘤組織中HPA mRNA表達(dá)量高于Ⅲ級(jí) （P＜0.05），這提示HPA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可能是HPA基因被激活[14]，并且可以反映疾病的嚴(yán)重程度。Ⅳ級(jí)腫瘤組織中HPA陽性率高于Ⅲ級(jí)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這可能是由于病例標(biāo)本較少導(dǎo)致，下一步研究應(yīng)擴(kuò)大樣本量來證實(shí)。發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中HPA陽性率為94.17%，而未轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞中HPA陽性的55.17%（P＜0.05），這說明HPA參與腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。

RNA干擾是指通過在細(xì)胞中導(dǎo)入與mRNA同源的dsRNA，使mRNA降解，從而沉默該基因的表達(dá)[15]。這為抗腫瘤治療提高了一條新思路，在本次的Transwell試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)通過采用siRNA沉默HPA基因的表達(dá)后，轉(zhuǎn)染組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)顯著低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組（P＜0.05），說明經(jīng)過轉(zhuǎn)染后，腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力明顯下降，并且HPA基因也可以作為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)。有學(xué)者[16]稱，RNA干擾成功的關(guān)鍵在于siRNA序列的設(shè)計(jì)，采用不同序列的siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，造成的抑制作用效果不一樣，這為下步研究提供了新方向，尋找抑制作用最好的siRNA。

綜上所述，HPA在人腦星形細(xì)胞瘤高度表達(dá)，隨著惡性程度的升高，HPA表達(dá)也相應(yīng)升高，通過siRNA沉默HPA基因表達(dá)，可以使腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力顯著降低。