NaCl-CaCl2處理對發(fā)芽大豆酚類物質(zhì)富集及抗氧化能力的影響

余茜，馬燕，范丹君，龔茹怡，王沛，顧振新，楊潤強

(南京農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，江蘇 南京，210095)

酚類物質(zhì)是高等植物中廣泛存在的一類次生代謝產(chǎn)物，在植物組織中通常以酯化或者糖苷化的形式存在，是植物抗氧化系統(tǒng)的重要組成，具有抗氧化、抗菌、抗癌等多種生物活性[1]。已發(fā)現(xiàn)的多酚類化合物有8 000多種，根據(jù)其不同的化學結(jié)構(gòu)至少可分為10類，比如簡單的小分子物質(zhì)酚酸，高度聚合的復雜化合物單寧等[2]。人們對植物食品原料中黃酮類物質(zhì)的研究較多，而對于酚酸類物質(zhì)的研究相對滯后，直到20世紀80年代初，植物食品原料中酚酸的提取和純化工藝被系統(tǒng)提出后，酚酸類物質(zhì)的研究才開展起來[3]。近年來研究表明，酚酸類化合物同樣具有抗菌[4]，抗氧化[5]和抗癌[6]等一系列生物活性。代沙[7]研究發(fā)現(xiàn),紫蘇葉提取物的抗氧化活性主要與酚酸類中的迷迭香酸和咖啡酸呈顯著性關(guān)系，徐良雄等[8]在比較不同花卉抗氧化能力時發(fā)現(xiàn)，抗氧化活性與多酚含量呈顯著的線性關(guān)系，而與黃酮含量無關(guān)。研究酚酸的富集，對提高食品原料的抗氧化能力有一定的幫助。

種子萌發(fā)是高等植物生命活動最強烈的一個時期，涉及到一系列形態(tài)和生理生化的變化，前人研究表明，大豆萌發(fā)能夠使大豆中原來含量低或不具有的功能成分如γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)[9]、總酚[10]、總黃酮[11]、異黃酮[12-13]等顯著增加。已有研究表明,控制一定發(fā)芽條件，可使這些功能性成分富集[14-15]。其中關(guān)于酚類物質(zhì)的富集多集中于鹽脅迫下，而關(guān)于低濃度鹽對大豆酚類物質(zhì)的影響鮮有報道，基于此，本試驗研究了低濃度NaCl、CaCl2及NaCl-CaCl2聯(lián)合處理對大豆芽苗生長狀況，酚類物質(zhì)含量及抗氧化能力的影響，為開發(fā)功能性大豆食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆，品種為“云鶴”，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院提供。甲醇，乙酸乙酯，氯化鈉，購自南京杰汶達生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS), 6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)，購自上海麥克林生化科技有限公司；沒食子酸，原兒茶酸，對羥基苯甲酸，香草酸，咖啡酸，紫丁香酸，對香豆酸，阿魏酸，芥子酸，均購自美國Sigma公司。配制以上試劑的水為超純水，甲醇為色譜純，其余為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

755B型分光光度計，上海精密科學儀器有限公司；島津LC-20A高效液相色譜儀，島津科學儀器；TDL-40B離心機，上海安亭科學儀器廠；WH-3微型旋渦混合儀，上海滬西分析儀器廠；DHG-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；DZF-6020型真空干燥器上海一恒科技有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；ZFA-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海玻璃儀器二廠；PYX-DHS-50X65-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 實驗設(shè)計

選取適量籽粒飽滿、大小均一的優(yōu)質(zhì)大豆，用去離子水漂洗除去雜質(zhì)后置于1%(v/v) NaClO水溶液中浸泡消毒15 min，之后用去離子水沖洗至pH中性后置于30 ℃水浴鍋中，用去離子水(1∶5(g∶mL))浸泡6 h。將浸泡后的大豆均勻攤于發(fā)芽機的苗盤上，置于30 ℃培養(yǎng)箱中避光發(fā)芽。分別設(shè)以下處理：

(1)對照(去離子水)；

(2)NaCl處理(1.5 mmol/L NaCl)；

(3)CaCl2處理(6 mmol/L CaCl2)；

(4)NaCl+CaCl2處理(1.5 mmol/L NaCl+6 mmol/L CaCl2)；

處理過程中，每隔24 h更換1次培養(yǎng)液，發(fā)芽時間4 d，取樣清洗后用吸水紙吸干，一部分樣品用于測定大豆芽苗生長指標(芽長、鮮重、干重)，其余樣品真空冷凍干燥，粉碎至過40目篩測定總酚含量、酚酸含量及抗氧化指標(DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力)。

1.3.2 生長指標的測定

芽長：隨機選取30株大豆芽苗，用游標卡尺測定其芽長，計算平均值。

鮮重：隨機選取30株大豆芽苗，用去離子水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分，稱重。

干重：隨機選取30株大豆芽苗，用去離子水沖洗干凈，吸水紙吸干表面水分，采用烘干恒重法測定。

1.3.3 游離酚的提取

參考CHEN等[16]的方法。大豆芽苗真空冷凍干燥后，用粉碎機粉碎，過40目篩(0.45 mm孔徑)得到不同處理的樣品。準確稱取2.0 g樣品用80%甲醇提取3次(每次20 mL)：在振蕩器上200 r/min振蕩1 h，室溫(25 ℃)條件下充氮氣避光提取，然后在10 000 r/min，4 ℃下離心15 min，離心后將提取液合并過濾，在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用50%甲醇溶解定容至10 mL作為游離酚提取液，充氮氣后于-20 ℃放置供分析用。

1.3.4 結(jié)合酚的提取

參考CHEN等[16]的方法。提取游離酚后的殘余物用40 mL 2 mol/L NaOH水解，混合物放在振蕩器200 r/min條件下振蕩水解4 h，室溫(25 ℃)條件下充氮氣避光提取，水解液用6 mmol/L HCl調(diào)整pH值在1.5～2.0，取50 mL乙酸乙酯與水解液充分混合15 min后，靜置5 min，然后混合液在10 000 r/min，4 ℃下離心5 min，取上層乙酸乙酯層。重復此操作3次，合并乙酸乙酯層于40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用50%甲醇溶解定容至10 mL作為結(jié)合酚提取液，充氮氣后于-20 ℃放置供分析用。

1.3.5 總酚含量測定

采用福林-酚法測定[16]。分別取上述提取液200 μL(適當稀釋)加入1.5 mL 10倍稀釋的福林-酚試劑，渦旋后靜置5 min，然后加入1.5 mL 75 g/L Na2CO3溶液混勻，置于室溫下避光反應(yīng)2 h，在765 nm處測定吸光值。以50%甲醇溶液代替提取液作為空白對照。以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，總酚含量以μg GAE/株計。

1.3.6 酚酸含量測定

參考CHEN等[16]的方法。分別取20 μL上述提取液(1.4.2和1.4.3)經(jīng)0.45 μm的有機濾膜過濾后采用高效液相進行分析：采用島津LC-20A高效液相色譜，配備C18110A色譜柱(5 μm粒徑，4.6 mm×150 mm)，高效液相的條件如下：流速為0.9 mL/min，流動相A溶液為0.1%的醋酸水溶液，B溶劑為0.1%的醋酸甲醇溶液。高效液相的流動程序為：0～11 min，9%～14% B；11～14 min，14%～15% B；14～17 min，15% B；17～24 min，15%～16.5% B；24～28 min，16.5%～19% B；28～30 min，19%～25% B；30～36 min， 25%～26% B；36～38 min；26%～28% B； 38～41 min，28%～35% B；41～46 min，35%～40% B；46～48 min，40%～48% B；48～53 min，48%～53% B；53～65 min，53%～70% B；65～66 min，70%～90% B；66～75 min，9% B。柱溫35 ℃，測定波長280 nm。

1.3.7 抗氧化指標

1. 3.7.1 DPPH自由基清除能力

參考YANG等[17]的方法。取上述提取液200 μL(適當稀釋)加入3.8 mL DPPH溶液，渦旋后置于室溫下避光反應(yīng)1 h，在515 nm處測定吸光值A(chǔ)。以50%甲醇溶液代替提取液作為空白對照Acontrol。以Trolox配制標準曲線，DPPH清除率以μmol TE/株計。

1. 3.7.2 ABTS自由基清除能力

參考CHEN等[16]的方法。取上述提取液100 μL(適當稀釋)加入3.0 mL ABTS·+溶液，渦旋后置于室溫下避光反應(yīng)30 min，在734 nm處測定吸光值A(chǔ)。以50%甲醇溶液代替提取液作為空白對照Acontrol。以Trolox配制標準曲線，ABTS清除率以μmol TE/株計。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 8.1軟件Duncans多重比較法進行方差分析，采用Origin 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對大豆芽苗生長指標的影響

從圖1-A可以看出，與對照相比，低濃度NaCl、CaCl2及NaCl-CaCl2聯(lián)合處理4 d后均能顯著促進大豆芽苗的生長，分別較對照提高了31.9%、77.6%和69.8%，其中CaCl2處理增加幅度最大。圖1-B則表明3種不同的鹽處理都能增加大豆芽苗的鮮重，增幅分別為6.2%、12.6%和17.3%，而在NaCl處理下，大豆芽苗的干重則有所降低，比對照減少了4.2%(圖1-C)。NaCl-CaCl2聯(lián)合處理的大豆芽苗，其鮮重和干重都要高于其他處理，這說明NaCl和CaCl2都可以調(diào)控植物生長，且兩者共同處理下效果更明顯。

圖1 不同處理對大豆芽苗芽長(A)、鮮重(B)和干重(C)的影響

Fig.1 Effects of different treatments on length (A), fresh weight (B) and dry weight (C) of soybean sprouts注：不同小寫字母代表同一指標不同處理間在0.05水平差異顯著。下同。

NaCl長期以來被認為是一種重要的非生物脅迫因子，可造成植物鹽害，嚴重影響著世界干旱和半干旱地區(qū)作物的生長發(fā)育和產(chǎn)量[18]。目前關(guān)于NaCl的研究也主要集中在其對植物的脅迫作用及植物的耐鹽性方面的研究，關(guān)于低濃度NaCl對植物的生長發(fā)育方面研究較少[19]，然而近年來的一些研究證實，雖然高濃度NaCl對植物有害，但植物生長的確需要一定量的Na+和Cl-。有研究表明，低濃度NaCl(5、10 mmol/L)能夠增加蕎麥芽苗的可溶性糖和維生素C，提高芽苗產(chǎn)量[20]，顯著促進菠菜的生長，增加葉綠素和蛋白質(zhì)的含量并提高產(chǎn)量[21]。這與本實驗結(jié)果較為一致：低濃度NaCl不僅不產(chǎn)生鹽害作用,反而能促進植物生長。

關(guān)于CaCl2的研究集中于其在緩解鹽脅迫中發(fā)揮作用，李華等[22]證實，噴施CaCl2能夠顯著提高鹽脅迫下黃瓜幼苗的干鮮重，顯著減少丙二醛和脯氨酸的積累，從而減輕鹽脅迫傷害，促進黃瓜植株生長，提高生物量積累。有報道指出，用鈣處理幼苗能明顯提高玉米幼苗葉片中腐胺(Put)、亞精胺(Spd)、精胺(Spm)的含量，且鈣能抑制膜脂在鹽脅迫下植物中丙二醛(MDA)的積累，從而減輕對細胞的傷害[23]。這說明一定濃度的CaCl2對植物的生長有促進作用，與本實驗結(jié)果相符。

2.2 不同處理對大豆芽苗總酚及酚酸含量的影響

多酚類物質(zhì)以游離和結(jié)合兩種形式存在于植物中，結(jié)合形式又分為可溶性結(jié)合和不可溶結(jié)合兩種形式，其中游離狀態(tài)多酚物質(zhì)主要以原花青素、類黃酮類為主，結(jié)合酚多為酚酸類，能與纖維素、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素、類黃酮、葡萄糖、酒石酸等結(jié)合的形式存在于植物組織的初生壁和次生壁中[24]。對于谷物籽粒，結(jié)合形式多酚占絕大部分(玉米85%、燕麥75%、小麥75%、大米62%)[25]，而對于豆類籽粒，其多酚類物質(zhì)以游離形式為主，主要為黃酮類物質(zhì)，結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)中的酚酸類成分則缺乏深入研究。由圖2可以看出，NaCl、CaCl2及NaCl-CaCl2聯(lián)合處理均能顯著提高發(fā)芽大豆的游離酚和結(jié)合酚含量，其中游離酚含量分別較對照提高了5.5%、12.5%和16.7%，結(jié)合酚含量則分別提高了5.7%、21.9%和30.0%。這與低鹽處理促進芽苗生長有密切關(guān)系，在籽粒發(fā)芽過程中，植物細胞壁周圍的很多成分降解，從而游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的酚類化合物得以釋放，進而使總酚含量明顯增加[26]，一方面芽苗生長過程中結(jié)合態(tài)的酚類物質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，游離酚含量增加，另一方面芽苗不斷生長，植物細胞壁面積增大，結(jié)合酚含量也不斷增加。另外，適度鹽處理使得植物籽粒發(fā)芽中酶的合成量增多，活性加大，有利于酚類物質(zhì)的加速合成。

圖2 不同處理對大豆芽苗游離酚(A)和結(jié)合酚(B)含量的影響

Fig.2 Effects of different treatments on the content of free phenolics (A) and bound phenolics (B) in soybean sprouts

2.3 不同處理對大豆芽苗酚酸含量的影響

酚酸是谷物中主要的酚類化合物[27]，具有抗氧化、清除自由基、抑制突變和抗腫瘤、抗血小板凝集、抗菌等重要的生理功能，對人體的健康具有獨特的保健作用，是一種極具開發(fā)價值的潛在天然化合物。對于大豆中的酚類物質(zhì)研究主要集中于黃酮和異黃酮，對于酚酸的研究相對較少。由圖3-A可看出，對照組發(fā)芽大豆中游離酚酸主要是對香豆酸，NaCl單獨處理不僅增加了對香豆酸含量，也增加了酚酸種類——香草酸，改變了游離酚酸組成。CaCl2和NaCl-CaCl2聯(lián)合處理均大幅增加了對香豆酸和香草酸含量，其中CaCl2單獨處理分別是對照的2.39和3.96倍，NaCl-CaCl2聯(lián)合處理則是對照的2.04和4.48倍。這與付曉燕[28]研究發(fā)現(xiàn)在燕麥發(fā)芽后檢測出了原本沒有的原兒茶酸和沒食子酸一致，說明調(diào)控發(fā)芽條件可以改變酚酸的種類。從圖3-B可看出，大豆芽苗中結(jié)合酚酸含量較多的是對香豆酸和紫丁香酸，其次是阿魏酸、香草酸和芥子酸。NaCl處理在一定程度上抑制了結(jié)合酚酸的形成，所檢測的7種結(jié)合酚酸中除了對羥基苯甲酸基本持平外，其他6種都有所降低。而CaCl2處理和NaCl-CaCl2聯(lián)合處理都能顯著提高結(jié)合酚酸的含量，其中對香豆酸增加幅度最大，分別較對照提高了100.3%和110.6%；其次為香草酸，分別提高了56.9%和80.9%；紫丁香酸則分別提高了55.8%和41.0%；阿魏酸分別提高了33.7%和41.1%；芥子酸分別提高了52.7%和57.2%。

圖3 不同處理對大豆芽苗游離酚酸(A)和結(jié)合酚酸(B)含量的影響

Fig.3 Effects of different treatments on the contents of free phenolic acids (A) and bound phenolic acids (B) in soybean sprouts

2.4 不同處理對大豆芽苗抗氧化能力的影響

圖4 不同處理對大豆芽苗游離酚(A)和結(jié)合酚(B)DPPH清除能力的影響

Fig.4 Effects of different treatments on DPPH scavenging capacity of free phenolics (A) and bound phenolics (B) in soybean sprouts

由圖4可看出NaCl和CaCl2對大豆芽苗的DPPH清除能力影響很大，無論游離酚還是結(jié)合酚的DPPH清除能力在NaCl、CaCl2處理下都得到了很大的提高，且NaCl-CaCl2聯(lián)合處理的效果最為顯著，其中游離酚的DPPH清除能力分別較對照組提高了8.3%，21.5%和27.6%，結(jié)合酚則分別提高了66.8%，230.6%和311.2%。不同處理條件下，大豆芽苗的ABTS清除能力變化趨勢與DPPH清除能力基本一致，3種低鹽處理均能使其顯著增加(如圖5所示)。通過與總酚、酚酸含量進行分析，可看出游離酚和結(jié)合酚的DPPH清除能力、ABTS清除能力與總酚含量呈正相關(guān)變化趨勢。低鹽處理可通過影響總酚和酚酸含量來影響大豆芽苗的抗氧化能力。由此可見，NaCl-CaCl2處理對增強大豆芽苗的酚類物質(zhì)含量及提高其抗氧化能力具有重要作用。

圖5 不同處理對大豆芽苗游離酚(A)和結(jié)合酚(B)ABTS清除能力的影響

Fig.5 Effects of different treatments on ABTS scavenging apacity of free phenolics (A) and bound phenolics (B) in soybean sprouts

3 討論

已有研究表明，鹽脅迫可以增加馬郁蘭中咖啡酸、香草酸、沒食子酸和反式-2-羥基肉桂酸等酚酸的含量[29]，通過NaCl處理也能在一定程度上提高糯米中對香豆酸、阿魏酸和原兒茶酸的含量[30]以及蕎麥苗中酚酸，類胡蘿卜素和抗氧化活性水平[31]。本實驗證明除了脅迫下，低濃度的NaCl和CaCl2處理可有效提高大豆芽苗總酚和酚酸含量，提高其抗氧化能力。推測其機理，一方面與低鹽促進大豆芽苗生長，加速游離態(tài)酚類化合物的釋放和結(jié)合態(tài)酚類化合物的形成有關(guān)：其中Na+對植物細胞伸展和水分平衡效應(yīng)有刺激作用，Na+能在液泡中代替K+產(chǎn)生溶質(zhì)勢，從而引起膨壓的產(chǎn)生和細胞的伸展[32]；而Ca2+在植物體內(nèi)是以二價陽離子形式存在，是構(gòu)成細胞壁的重要成分[33]，Ca2+可以交聯(lián)果膠的負電荷，從而維持細胞壁結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并且參與植物的生長、發(fā)育、調(diào)節(jié)氣孔開合等多個生理過程[34]。另一方面與鈣作為植物細胞的第二信使，對環(huán)境信號等許多刺激有靈敏反應(yīng)有關(guān)。低鹽處理引起了植物胞內(nèi)Ca2+水平的改變，產(chǎn)生Ca2+信號，鈣是一些重要酶和輔酶的活化劑，細胞內(nèi)的Ca2+可作為第二信使與環(huán)狀多肽結(jié)合形成鈣調(diào)素，參與多種生理生化過程及酶活性的調(diào)節(jié)，其中酚類物質(zhì)合成的第一限速酶PAL能被Ca2+調(diào)節(jié)[35]，進而促進多酚的富集。其他方面可能是由于低鹽改變了植物生長環(huán)境，引起了植物內(nèi)源激素水平的改變，進而影響了酚類等次級代謝產(chǎn)物的積累。另外，Ca2+對內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)功能起著強烈的修飾作用，鈣信使系統(tǒng)可能在植物激素信號傳遞中起著重要作用，鈣對激素的響應(yīng)有放大的作用。外源Ca2+能促進種子乙烯的產(chǎn)生，適宜的Ca2+濃度能促進膜系統(tǒng)中ACC向乙烯的轉(zhuǎn)化[36]，而乙烯可誘導植物PAL基因的表達[37]，進而引起酚類物質(zhì)的富集。由此推測，CaCl2可能通過調(diào)節(jié)乙烯含量刺激酚類物質(zhì)合成并在其中扮演信號傳遞的角色，這需要后續(xù)實驗進行深入研究和系統(tǒng)分析，徹底理清NaCl和CaCl2的調(diào)節(jié)機制、刺激信號傳導以及對其它激素的作用。