pH偏移結(jié)合溫和熱處理對蠶豆分離蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響

周向軍，董瑞紅，高義霞

(天水師范學(xué)院 生物工程與技術(shù)學(xué)院，甘肅 天水，741001)

蠶豆(ViciafabaL.)，豆科巢菜屬草本作物，富含淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素、維生素、礦物質(zhì)、原花色素及異黃酮等生物活性物質(zhì)。我國是世界上蠶豆種植面積和總產(chǎn)量最大的國家，分別占世界37.3%和32.6%[1]。蠶豆蛋白含量高達(dá)25%～30%[2]，僅次于大豆蛋白，含有人體必需的8種氨基酸，其氨基酸組成與人體所必需氨基酸比例接近，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源[3]，被認(rèn)為未來最有可能取代肉類蛋白[4]。處于極端pH條件下的蛋白質(zhì)，其分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)首先展開，逐漸調(diào)節(jié)pH至中性后，可發(fā)生重新折疊，即pH偏移。pH偏移可使蛋白質(zhì)處于變性與未變性之間的熔球態(tài)，通常保留變性前大部分二級結(jié)構(gòu)，但三級結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，正逐漸成為食品蛋白質(zhì)修飾的一種方法。LIU[5]等研究表明，pH偏移結(jié)合溫和熱處理，可使大豆分離蛋白質(zhì)的膠凝性、表面疏水性和顆粒大小增加，巰基向二硫鍵轉(zhuǎn)化并形成聚集體且溶解性降低，內(nèi)源性熒光表明大豆分離蛋白空間結(jié)構(gòu)解體，圓二色譜表明二級結(jié)構(gòu)遭到輕微破壞，該技術(shù)有助于改進(jìn)大豆分離蛋白的功能特性。NIU[6]等研究了天然大豆分離蛋白和pH偏移結(jié)合溫和熱處理后的大豆分離蛋白，以及肌原纖維蛋白熱穩(wěn)定性和成膠性的影響。結(jié)果表明，處理后的大豆分離蛋白，可增加肌原纖維蛋白凝膠壓力和減少水分損失，處理后大豆分離蛋白可增加氫鍵和二硫鍵，原子力顯微分析表明，處理后大豆分離蛋白可降低肌原纖維蛋白凝膠的粗糙性、凝膠性和持水力等。

國內(nèi)有關(guān)食品蛋白的研究，主要集中在提取、理化性質(zhì)、酶解工藝、抗氧化組分及活性肽制備等方面[7-11]，國外則集中在溶解性、乳化性、流變學(xué)、膠凝、表面形態(tài)、構(gòu)象和質(zhì)構(gòu)等方面[12-17]，有關(guān)pH偏移結(jié)合溫和熱處理蠶豆蛋白的研究未見報道。本實驗以pH1.5偏移結(jié)合25、37和55 ℃溫和熱處理不同時間后，逐漸恢復(fù)至中性，研究蠶豆分離蛋白(broad bean protein isolate，BBPI)溶解性、乳化性、巰基/總巰基含量、紫外和熒光光譜、表面疏水性、二級結(jié)構(gòu)含量和微結(jié)構(gòu)的變化，為BBPI在食品行業(yè)的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 試劑與方法

1.1 材料與儀器

蠶豆蛋白：江蘇鹽城朱港村五谷行。8-苯胺基-1-萘磺酸鈉(ANS)：東京化成工業(yè)株式會社；Ellman試劑：BBI；牛血清白蛋白：生工生物工程(上海)股份有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250、甘氨酸、尿素、硼酸、DTNB、Tris、EDTA、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和正己烷等均為國產(chǎn)分析純。

RF-5301PC熒光分光光度計、UV-1800紫外可見分光光度計，日本島津；722可見分光光度計，上海欣茂有限公司；PHS-3D雷磁pH計，上海精密科學(xué)有限公司；TGL-20M型高速臺式冷凍離心機(jī)，湘儀離心機(jī)儀器有限公司；AL-204型電子天平，梅特勒-托利多有限公司；90-3型定時恒溫雙向磁力攪拌器，上海亞榮生化儀器廠；KDF-103F自動定氮儀，上海纖檢儀器有限公司； JSM-6701F冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本電子；Nicolet-iS5傅立葉變換紅外光譜儀，美國Thermo fisher。

1.2 方法

1.2.1 BBPI制備

參照曾茂茂的方法[18]，稍作修改。取50 g蠶豆粉，按料液比1∶3(g∶mL)加入正己烷，脫脂2次，5 000 r/min離心15 min，沉淀分散于1 250 mL 0.1 mol/L NaCl溶液中，調(diào)pH 7.5～8.0，40 ℃水浴攪拌3 h，5 000 r/min離心15 min，上清液調(diào)pH4.5酸沉，靜置過夜。8 000 r/min離心15 min，水洗1～2次，沉淀干燥備用。經(jīng)凱氏定氮法測定，BBPI蛋白含量為(77.65±0.23)%。

1.2.2 溶解性

0.1 mg/mL牛血清白蛋白0.0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mL，分別加入0.1 mg/mL考馬斯亮藍(lán)3.0 mL，混勻595 nm測光吸收值。以牛血清白蛋白質(zhì)量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=10.249X+0.018 3，R2=0.992 5，X為蛋白質(zhì)量，mg，Y為光吸收值。利用0.01 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液配置5%BBPI，調(diào)pH至1.5后，分別在25、37和55 ℃條件下水浴。0、1.5、3.5和5.5 h時，取10～15 mL調(diào)pH7.0，混勻靜止1 h。攪拌分散30 min后，5 000 r/min離心15 min，稀釋后取0.5 mL上清液測光吸收值[19]。總蛋白含量采用凱氏定氮法測定。

(1)

1.2.3 乳化性

利用0.05 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液配置2%BBPI，其余同1.2.2。9.0 mL 2%BBPI與3.0 mL菜籽油混合，均質(zhì)3 min，立刻在底部吸取60 μL乳化液加至15 mL 0.1%SDS中，振蕩混勻后在500 nm測定光吸收值，根據(jù)公式(2)計算乳化活力指數(shù)(EAI)，10 min后測定光吸收值，根據(jù)公式(3)計算乳化穩(wěn)定性(ESI)[20]。

(2)

(3)

式中:n,稀釋倍數(shù),250；ρ,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,g/mL；ω,乳化液中油相體積分?jǐn)?shù)(1/4)；A0,0 min時吸光值；A10,10 min時吸光值；L,比色皿厚度，1 cm。

1.2.4 活性巰基測定

參照盧巖的方法[21]，稍作修改。利用0.01 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液配置2%BBPI，其余同1.2.2。1.0 mL 2%BBPI加入pH 8.0 Tris-甘氨酸溶液8.0 mL，均質(zhì)后10 000 r/min離心15 min。4.5 mL上清液和0.5 mL 10 mmol/L Ellman(pH 8.0 Tris-Gly溶解)試劑反應(yīng)，空白含4.5 mL Tris-Gly和0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑，30 min后在412和540 nm測定光吸收值。

活性巰基含量/(μmoL·g-1)= 73.53×(A412-1.693 4A540

+0.009 932)

(4)

1.2.5 總巰基測定

參照李學(xué)鵬的方法[22]，稍作修改。利用0.01 mol/L pH7.0磷酸緩沖液配置2%BBPI，其余同1.2.2。1.0 mL 2%BBPI加入8.0 mL Tris-Gly溶液(含8.0 moL/L尿素)，均質(zhì)后10 000 r/min離心15 min。4.5 mL上清液和0.5 mL 10 mmol/L Ellman試劑反應(yīng)，空白為4.5 mL Tris-Gly+0.5 mL Ellman試劑，30 min后412 nm測定光吸收值。巰基摩爾消光系數(shù)13 600 L/(mol·cm)，總蛋白含量(c)測定采用凱氏定氮法。

(5)

式中:A,除去試劑空白后樣品的吸光值；D,稀釋倍數(shù)，9；ρ,蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,mg/mL。

1.2.6 紫外和熒光光譜

利用0.01 mol/L pH7.0磷酸緩沖液配置2.0 mg/mL BBPI，其余同1.2.2。以0.01 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液為空白，在270～320 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，制作二階導(dǎo)數(shù)譜。利用0.01 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液配置2.0 mg/mL BBPI，其余同1.2.2。在激發(fā)波長281 nm條件下，掃描250～450 nm范圍發(fā)射光譜，以波長為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖。

1.2.7 表面疏水性

參照KATO[23]法，稍作修改。利用0.01 mol/L pH7.0磷酸緩沖液配置2%BBPI，其余同1.2.2。0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL上清液，用0.01 mol/L pH7.0磷酸緩沖液補(bǔ)至4.0 mL，加入50 μL 8.0 mmol/L ANS(0.01 mol/L pH7.0磷酸鹽緩沖液溶解)，混勻靜置5 min。在激發(fā)波長349 nm，發(fā)射波長490 nm，夾縫均為5 nm條件下，測定熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度對BBPI濃度作圖，初始段斜率為表面疏水性指數(shù)。以時間為橫坐標(biāo)，表面疏水性指數(shù)為縱坐標(biāo)作圖。

1.2.8 電鏡掃描

利用0.01 mol/L pH7.0磷酸緩沖液配置5%BBPI，調(diào)pH1.5后分別在25、37和55 ℃下水浴1.5 h后調(diào)pH 7.0，混勻8 000 r/min離心5 min，取上清液。涂片，待干后噴金掃描。

1.2.9 紅外光譜分析和譜圖處理

1.2.8中處理的BBPI上清液進(jìn)行真空冷凍干燥。1 mg BBPI與200 mg KBr均勻混合，壓片，掃描次數(shù)64次，分辨率4 cm-1，增益為1。對光譜進(jìn)行水汽和二氧化碳校正，掃描范圍400～4 000 cm-1，采用DTGS檢測器進(jìn)行紅外光譜測定。采用Omnic 8.2軟件在酰胺I帶范圍內(nèi)(1 700～1 600 cm-1)進(jìn)行基線校正、去卷積和二階求導(dǎo)處理，并利用Peakfit 4.12軟件對二階導(dǎo)數(shù)曲線擬合至R2≥0.99，根據(jù)峰面積計算BBPI二級結(jié)構(gòu)的百分含量。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 16.0進(jìn)行顯著性分析(P<0.05)，采用Origin 7.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶解性

pH偏移結(jié)合溫和熱處理對BBPI溶解性的影響見圖1。蛋白質(zhì)溶解性取決于疏水作用力、氫鍵和靜電力等分子間作用力，以及pH、鹽種類和離子強(qiáng)度等外在因素。pH 1.5結(jié)合25、37和55 ℃分別處理0、1.5、3.5和5.5 h后，其時間-溶解度曲線均呈V型曲線。在0～1.5 h范圍內(nèi)時，各組溶解性均出現(xiàn)下降趨勢，在1.5～5.5 h范圍內(nèi)時，37和55 ℃處理組溶解性明顯增加(P<0.05)，這是因為pH 1.5處理首先使BBPI徹底變性，疏水基團(tuán)外露，分子間疏水作用迅速增強(qiáng)而成為主要因素，因而溶解性下降。由于BBPI等電點為4～4.2[24]，繼續(xù)延長處理時間，大部分BBPI帶正電荷，分子間斥力逐漸成為主要因素，使BBPI與水分子間作用力增強(qiáng)，因此溶解性增加。與pH 7.0,25 ℃相比，各組溶解性均明顯增加，且pH 1.5，55 ℃處理組溶解性最高，這是因為適度增溫有利于加大分子擴(kuò)散而防止聚集，但相應(yīng)25和37 ℃處理組并未隨時間增加呈現(xiàn)明顯對應(yīng)關(guān)系。

圖1 pH偏移結(jié)合溫?zé)崽幚韺BPI溶解性的影響

Fig.1 Effects of pH-shifting and mild heating on solubility of BBPI

2.2 乳化性和乳化穩(wěn)定性

pH偏移結(jié)合溫和熱處理對BBPI乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響見圖2和圖3。

圖2 pH偏移結(jié)合溫?zé)崽幚韺BPI乳化性的影響

Fig.2 Effects of pH-shifting and mild heating on the emulsibility of BBPI

圖3 pH偏移結(jié)合溫?zé)崽幚韺BPI乳化穩(wěn)定性的影響

Fig.3 Effects of pH-shifting and mild heating on the emulsion stability of BBPI

當(dāng)處理時間為0～3.5 h時，各組乳化性開始下降，3.5～5.5 h又逐漸增加。原因可能是經(jīng)過酸處理后，BBPI形成了類似于“熔球態(tài)”結(jié)構(gòu)，即其二級結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，但其三級結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度變化，且該變化先降低了乳化性，隨后由于更多疏水氨基酸的暴露，表面活性開始逐漸增強(qiáng)[25]。與pH 7.0，25 ℃相比，各組乳化性幾乎均出現(xiàn)下降，但與溫度具有明顯的正相關(guān)性。與pH 7.0，25 ℃相比，各組乳化穩(wěn)定性均出現(xiàn)下降，這說明雖然pH 1.5處理可誘導(dǎo)BBPI空間結(jié)構(gòu)逐漸展開，疏水多肽鏈變得更加松散，但當(dāng)調(diào)節(jié)至pH 7.0時，部分展開的BBPI重新相互作用，使乳化穩(wěn)定性降低[25]。pH 1.5，55 ℃處理組乳化性出現(xiàn)波動，原因可能是其1.5 h后少量BBPI發(fā)生聚合作用，隨時間延長，界面分子柔性增加又使得乳化穩(wěn)定性逐漸增強(qiáng)。

2.3 活性巰基和總巰基

pH偏移結(jié)合溫和熱處理對BBPI活性巰基和總巰基含量的影響見圖4和圖5。對巰基而言，在0～1.5 h范圍內(nèi)，各組巰基含量逐漸增加，此時BBPI內(nèi)部巰基暴露速度快于新二硫鍵生成速度。在1.5～5.5 h范圍內(nèi)時，各組變化無明顯規(guī)律：pH 1.5，25 ℃處理組的巰基含量增加不明顯(P>0.05)，這可能是分子內(nèi)巰基和二硫鍵交換比較頻繁所致，pH 1.5,37 ℃組繼續(xù)增至最大值，3.5 h后開始下降，pH 1.5,55 ℃組則1.5 h后迅速下降(P<0.05)，這說明適度增溫(37和55 ℃)均易加速巰基氧化或巰基與二硫鍵交換，從而使巰基含量出現(xiàn)下降趨勢[26]。

圖4 pH偏移結(jié)合溫?zé)崽幚韺BPI巰基含量的影響

Fig.4 Effects of pH-shifting and mild heating on sulfhydyyl content of BBPI

圖5 pH偏移結(jié)合溫?zé)崽幚韺BPI總巰基含量的影響

Fig.5 Effects of pH-shifting and mild heating on total sulfhydryl content of BBPI

對總巰基而言，其含量約為巰基含量10倍以上，原因是長時間極端酸性條件處理，BBPI結(jié)構(gòu)充分展開使內(nèi)部巰基暴露，也可能是BBPI亞基解離，二硫鍵斷裂生成巰基所致，這與HWANG報道一致[27]。在0～3.5 h范圍內(nèi)，pH 1.5,25 ℃和pH 1.5,55 ℃處理組的總巰基含量變化不明顯(P>0.05)，隨時間延長，總巰基含量開始下降。而pH 1.5,37 ℃組則在0～1.5 h范圍內(nèi)，總巰基含量先增加，隨后明顯下降，這說明25和55 ℃處理一定時間后，巰基和二硫鍵相互轉(zhuǎn)化幾乎處于平衡，而37 ℃處理則首先表現(xiàn)為二硫鍵的氧化程度超過巰基還原，隨時間延長，巰基還原程度又逐漸超越二硫鍵的氧化，因此總巰基含量下降。

2.4 紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜

由于Phe、Tyr和Trp在280 nm處均有較強(qiáng)吸收，導(dǎo)致峰信號重疊而難以辨認(rèn)，因此可利用紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜描述其對應(yīng)的結(jié)構(gòu)變化[28]。pH 1.5偏移結(jié)合溫和熱處理對BBPI紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜的影響見圖6(25 ℃)、圖7(37 ℃)和圖8(55 ℃)。在280～300 nm范圍內(nèi)，未處理組BBPI出現(xiàn)兩個正吸收峰(289 nm和295 nm)和兩個負(fù)吸收峰(285 nm和291 nm)。295 nm處正吸收峰是色氨酸的貢獻(xiàn)[29]。當(dāng)pH 1.5偏移結(jié)合25 ℃處理不同時間后，BBPI在295 nm處發(fā)生1～2 nm紅移。隨時間延長，峰谷與峰頂距離比(r=a/b)先增加后減小，這表明，pH1.5偏移結(jié)合溫和熱處理后，BBPI三級結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度包裹，原來暴露在分子表面的Trp殘基重新包裹于BBPI疏水核心[30]。當(dāng)pH 1.5,37 ℃處理不同時間后，BBPI在295 nm處發(fā)生1～2 nm藍(lán)移，且峰谷與峰頂距離比增加，表明部分已暴露的Trp殘基開始發(fā)生解折疊而暴露于分子表面。pH 1.5+55 ℃處理不同時間后，BBPI在295 nm處未發(fā)生明顯移動，峰谷與峰頂距離比未有明顯規(guī)律。

圖6 pH偏移結(jié)合溫?zé)崽幚韺BPI紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜的影響

Fig.6 Effects of pH-shifting and mild heating processes on UV second derivative spectra of BBPI

圖7 pH偏移結(jié)合溫?zé)崽幚韺BPI紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜的影響

Fig.7 Effects of pH-shifting and mild heating processes on UV second derivative spectra of BBPI

圖8 pH偏移結(jié)合溫?zé)崽幚韺BPI紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜的影響

Fig.8 Effects of pH-shifting and mild heating processes on UV second derivative spectra of BBPI

2.5 熒光光譜

pH偏移結(jié)合溫和熱處理對BBPI熒光光譜的影響見圖9(25 ℃)、圖10(37 ℃)和圖11(55 ℃)。各組內(nèi)源性熒光強(qiáng)度均低于未處理組，這充分說明pH1.5偏移結(jié)合溫和熱處理不同時間后，均可使BBPI分子表面Trp等殘基進(jìn)一步包裹在分子內(nèi)部疏水核心，即BBPI傾向于重折疊。對pH 1.5,25 ℃組，隨時間延長，熒光強(qiáng)度先降低后增強(qiáng)，且發(fā)生一定程度紅移，這可能是由于BBPI或其亞基在強(qiáng)酸性條件下，部分Trp疏水側(cè)鏈?zhǔn)紫劝l(fā)生暫時聚集，包裹在BBPI分子內(nèi)部非極性環(huán)境中，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。隨時間延長，其又逐漸暴露在分子表面極性環(huán)境中，但仍處于不穩(wěn)定狀態(tài)。這說明pH 1.5偏移結(jié)合25 ℃低溫處理時，在0～5.5 h范圍內(nèi)，BBPI色氨酸側(cè)鏈的聚集或暴露仍未達(dá)到平衡。對pH 1.5,37 ℃組，熒光強(qiáng)度先逐漸增加后又明顯降低，且均低于未處理組；對pH 1.5,55 ℃處理組，在0～1.5 h范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度顯著降低，隨后繼續(xù)增加處理時間，熒光強(qiáng)度降至恒值，這說明pH 1.5偏移處理時，適當(dāng)提高溫度可使BBPI徹底聚集，處理時間不影響熒光強(qiáng)度。

圖9 pH偏移結(jié)合溫?zé)崽幚韺BPI熒光光譜的影響

Fig.9 Effects of pH-shifting and mild heating processes on fluorescence spectra of BBPI

圖10 pH偏移結(jié)合溫?zé)崽幚韺BPI熒光光譜的影響

Fig.10 Effects of pH-shifting and mild heating processes on fluorescence spectra of BBPI

圖11 pH偏移結(jié)合溫?zé)崽幚韺BPI熒光光譜的影響

Fig.11 Effects of pH-shifting and mild heating processes on fluorescence spectra of BBPI

2.6 表面疏水性

pH偏移結(jié)合溫和熱處理對BBPI表面疏水性的影響見圖12。表面疏水性反映蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)中表面疏水基團(tuán)的分布情況，可影響溶解度、吸水性、乳化性和凝膠性等其他功能性質(zhì)。ANS是一種帶負(fù)電荷的陰離子探針，在pH 1.5酸性條件下，不僅和蛋白質(zhì)表面帶正電荷氨基酸殘基通過靜電相互作用而結(jié)合，且可蛋白質(zhì)表面暴露的疏水區(qū)域相結(jié)合，因此表面疏水性指數(shù)不僅反映的是BBPI表面疏水性，同時也反映了ANS與BBPI分子間的靜電引力[31]。溫度是影響B(tài)BPI結(jié)構(gòu)的重要因素，長時間50 ℃以上處理，BBPI分子結(jié)構(gòu)可發(fā)生重排，但不同的蛋白質(zhì)，可能呈現(xiàn)不同規(guī)律[32]?？傮w分析，pH 1.5偏移處理下，BBPI表面疏水性變化較為復(fù)雜，表明為其穩(wěn)定性較差[33]。在0～1.5 h范圍內(nèi)，各組表面疏水性均急劇增加，隨時間延長，除pH 1.5,55 ℃組外，其余兩組均顯著降低，原因可能是當(dāng)pH 1.5偏移處理后，包裹在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水側(cè)鏈暴露在分子表面，蛋白質(zhì)疏水性增強(qiáng)，但隨時間延長，蛋白質(zhì)并非只有一種結(jié)構(gòu)模式，BBPI展開后再聚集，依賴于疏水側(cè)鏈間相互作用而包埋在分子內(nèi)部[34-35]，從而降低了表面疏水性。在3.5～5.5 h范圍內(nèi)，pH 1.5,55 ℃組表面疏水性反而增加，原因可能是BBPI分子中α螺旋含量較小，約為15%[36]，而有證據(jù)表明α螺旋含量可能與溫度對表面疏水性指數(shù)的影響有關(guān)[32]。當(dāng)溫度超過50 ℃時且經(jīng)過3.5 h長時間處理后，β折疊作為分子間有序排列被不同程度破壞，α螺旋作為分子內(nèi)有序排列而增強(qiáng)[37]，因而表面疏水性增加。表面疏水性與溶解性幾乎呈負(fù)相關(guān)性，這主要是溶解性取決于BBPI分子親水性和疏水性的平衡，該平衡又取決于氨基酸組成，特別是分子表面氨基酸組成[34]。NAKAI[38]等研究認(rèn)為，表面疏水性與乳化性成正相關(guān)，本研究結(jié)果與其一致。

圖12 pH偏移結(jié)合溫?zé)崽幚韺BPI表面疏水性指數(shù)的影響

Fig.12 Effects of pH-shifting and mild heating on surface hydrophobicity index of BBPI

2.7 二級結(jié)構(gòu)含量測定

不同pH和溫和熱處理對BBPI二級結(jié)構(gòu)含量的影響見表1。一般情況下，1 600～1 639 cm-1和1 689～1 699 cm-1譜帶歸屬于β-折疊，1 640～1 650 cm-1譜帶歸屬于無規(guī)則卷曲，1 651～1 660 cm-1譜帶歸屬于α-螺旋，1 661～1 688 cm-1譜帶歸屬于β-轉(zhuǎn)角[39]。由表1可知，BBPI各二級結(jié)構(gòu)含量依次為：對pH 7.0,25 ℃處理組，β-折疊34.79%，α-螺旋50.63%，β-轉(zhuǎn)角14.59%；對pH 1.5,25 ℃處理組，β-折疊53.07%，無規(guī)則卷曲8.28%，α-螺旋6.28%，β-轉(zhuǎn)角32.37%；對pH 1.5,37 ℃處理組，β-折疊53.07%，無規(guī)則卷曲8.28%，α-螺旋6.29%，β-轉(zhuǎn)角32.36%；對pH 1.5,55 ℃處理組，無規(guī)則卷曲58.06%，β-轉(zhuǎn)角41.94%。由上述分析可知，在25～37 ℃范圍內(nèi)，pH 1.5偏移處理可使α-螺旋向β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)化，當(dāng)增至55 ℃時，α-螺旋和β-折疊全部轉(zhuǎn)化為β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。α-螺旋和β-折疊為BBPI的有序結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲為無序結(jié)構(gòu)，隨溫度不斷增加，BBPI的α-螺旋和β-折疊百分含量之和呈明顯降低趨勢，這表明BBPI穩(wěn)定性逐漸降低。

表1 不同pH和溫和熱處理對BBPI二級結(jié)構(gòu)含量的影響

2.8 電鏡掃描

圖13～圖16分別為BBPI在pH 7.0,25 ℃、pH 1.5,25 ℃，pH 1.5,37 ℃和pH 1.5,55 ℃條件下，處理1.5 h時掃描電鏡下的形貌。由圖13～圖16可知，不同溫度處理下，BBPI均形成大小不均勻的球狀體，粒徑約為80～130 nm。各球狀體存在團(tuán)聚現(xiàn)象，形成“溝壑”，如A、B、C區(qū)域所示，隨溫度增大，團(tuán)聚現(xiàn)象降低，可能與溶解性增強(qiáng)有關(guān)，但球體粒徑較為接近。與pH 7.0,25 ℃處理組比較，pH 1.5,25 ℃形貌變化不大，可能是1.5 h處理時間較長，不同程度抵消了pH 1.5處理對BBPI形貌等的影響。

圖13 pH 7.0,25 ℃條件下BBPI形貌

Fig.13 Morphology of BBPI at pH 7.0,25 ℃

圖14 pH 1.5,25 ℃條件下BBPI形貌

Fig.14 Morphology of BBPI at pH 1.5,25 ℃

圖15 pH 7.0,37 ℃條件下BBPI形貌

Fig.15 Morphology of BBPI at pH 7.0,37 ℃

圖16 pH 7.0,55 ℃條件下BBPI形貌

Fig.16 Morphology of BBPI at pH 7.0,55 ℃

3 結(jié)論

(1)隨時間延長，BBPI溶解性和乳化性均先降低后增加，但與pH 7.0,25 ℃處理組相比，各組溶解性均增加，乳化性幾乎均下降。乳化性隨溫度的升高而增強(qiáng)，但溶解性并不完全與溫度成正比。隨時間延長，乳化穩(wěn)定性無明顯規(guī)律，但均隨溫度增加而逐漸增強(qiáng)，37和55 ℃處理組巰基含量先增加后降低，25 ℃處理組則變化不大，37 ℃處理組總巰基含量先增加后迅速下降，25和55 ℃先平穩(wěn)后降低。

(2)紫外和熒光光譜表明，隨時間延長，25 ℃處理組的大部分色氨酸殘基包裹在分子內(nèi)部疏水微環(huán)境，發(fā)生1～2 nm紅移動，37 ℃處理組表現(xiàn)為色氨酸殘基開始部分性解折疊，色氨酸殘基又逐漸暴露在分子表面，發(fā)生1～2 nm藍(lán)移，55 ℃處理組則未有明顯變化。

(3)結(jié)果表明，BBPI的表面疏水性與溶解性呈負(fù)相關(guān)，與乳化性成正相關(guān)。25和37 ℃處理時，BBPI的表面疏水性先增加后降低，55 ℃處理則先增加后出現(xiàn)一定波動。

(4)隨溫度升高，BBPI二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋和β-折疊逐漸轉(zhuǎn)化為β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。隨溫度升高，BBPI電鏡掃描均形成粒徑約為80～130 nm的球狀體，且存在團(tuán)聚和“溝壑”現(xiàn)象，但團(tuán)聚現(xiàn)象逐漸降低。

(5)由于未變性或完全變性的蛋白具有相對較強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，功能特性并不十分理想，而通過pH偏移結(jié)合溫和熱處理改性處理，BBPI構(gòu)象發(fā)生一定程度變化而形成熔球態(tài)，則有望進(jìn)一步改善其起泡性、溶解性、乳化性、成膠性和成膜性等功能性質(zhì)，這將有助于進(jìn)一步提高BBPI的應(yīng)用價值和拓展其應(yīng)用范圍。