蛹蟲草蟲草多糖的分離純化、分子構(gòu)象分析及抗氧化活性研究

江琦，婁在祥*，王正齊，王洪新*，陳孝云

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(國家功能食品工程技術(shù)研究中心(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

蛹蟲草[Cordycepsmilitaris(L.ex Fr) Link]，分類學(xué)上屬麥角菌科(Clavicipitaceae)、蟲草屬(Cordyceps)，又稱北冬蟲夏草，是由子座(草部分)和菌核(蟲的尸體部分)兩部分組成的復(fù)合體，是可與冬蟲夏草媲美的我國傳統(tǒng)可食用的藥用真菌[1-2]。蟲草多糖作為蛹蟲草中所含活性物質(zhì)中最豐富、最重要的物質(zhì)，具有內(nèi)在的藥效功能，特別是抗氧化，免疫調(diào)節(jié)作用和抗腫瘤功能[3-6]。近年，國內(nèi)外的研究較多集中在蟲草多糖提取純化工藝的優(yōu)化和多糖藥理活性的研究方面，對多糖構(gòu)型分析、多糖組成等方面的報道還比較少見。據(jù)現(xiàn)代科學(xué)論證，蟲草等真菌多糖的物理性質(zhì)和藥理作用與多糖的分子質(zhì)量大小、分子量分布、糖苷鍵、支化程度以及構(gòu)象有著密切的聯(lián)系[7-8]。

采用多角度激光光散射凝膠滲透色譜和示差聯(lián)用技術(shù)(gel permeation chromatographymulti-angle laser light scattering-reflective index, GPC-MALLS-RI)可以直接測定聚合物重均分子量，是分析聚合物結(jié)構(gòu)的有效工具。該技術(shù)與傳統(tǒng)GPC相比，無需標(biāo)準樣品校正，且能夠獨立測定多糖的折光指數(shù)增量(dn/dc)值，保證檢測結(jié)果的可靠性。因此本文著重探究蟲草多糖的結(jié)構(gòu)，通過GPC-MALLS-RI和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)對柱層析純化的蛹蟲草蟲草多糖(Cordycepsmilitarispolysaccharide，CMP)進行表征，獲取單糖組成、分子量分布和構(gòu)象信息。通過傅里葉變換紅外光譜探討多糖的分子組成。此外，比較了粗多糖與純化多糖CMP的抗氧化活性。從分子構(gòu)型、分子量的角度以及抗氧化活性方面評價蛹蟲草多糖，旨在為活性研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用蛹蟲草為東北長白山野生蛹蟲草菌種，通過固態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵而來的子實體：含水量4.1%，由遵義鴻霖生物技術(shù)有限公司提供；二乙氨基乙基纖維素52(DEAE-52)填料，上海源葉生物科技有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；無水葡萄糖、單糖標(biāo)準品、DPPH和ABTS，上海Sigma-Aldrich公司。其他試劑均為分析純或者色譜純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 實驗儀器與設(shè)備

FW80高速粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司；AR224CN電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；UV-2100紫外分光光度計，尤尼柯儀器有限公司(上海)；BC-R206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司；SBS-100自動部分收集器，上海滬西分析儀器有限公司；BT100-1JDG1數(shù)顯恒流泵，重慶科耐普蠕動泵有限公司；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用儀(TSQ8000)，賽默飛世爾科技有限公司；多角度激光光散射凝膠色譜儀(DAWN HELEOS II)，美國懷雅特技術(shù)公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛹蟲草蟲草粗多糖的制備

取適量蛹蟲草子實體粉末，在微波條件下輔助提取蟲草多糖，提取液離心后取上清濃縮，加入多糖濃縮液體積1/4的Sevag試劑[V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1]離心除去蛋白，如此重復(fù)多次。用1.5 g/L的活性炭脫色，再加入4倍體積的無水乙醇沉淀多糖，4 ℃下靜置過夜后用分別用95%乙醇、無水乙醇和丙酮洗滌沉淀，最后真空干燥得到粗多糖，備用。用苯酚-硫酸法[9]測定蟲草粗多糖的含量。

1.3.2 蛹蟲草粗多糖的純化

樣品的預(yù)處理：準確稱取蟲草多糖粗品，用蒸餾水配制成25 g/L的溶液，待柱層析備用。

DEAE-52柱層析純化蟲草多糖：稱取100 g填料用蒸餾水浸泡出去懸浮雜質(zhì)，而后分別用0.5 mol/L的HCl和NaOH浸泡2 h，每次用蒸餾水洗至中性，最后真空抽干填料用蒸餾水浸泡裝柱(2.6 cm×30 cm)，預(yù)先用蒸餾水過夜平衡。用蒸餾水洗脫，流速為4 mL/min，每管收集8 mL。采用苯酚硫酸法檢測每管糖含量，并繪制以管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)的洗脫曲線，以洗脫曲線為準收集不同吸收峰段的多糖組分。將收集的多糖組分50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原液的1/5后透析(3000D)48 h，而后冷凍干燥得到中性蟲草多糖粉末(CMP)。采用1.3.1中苯酚硫酸法測定CMP質(zhì)量分數(shù)，并用BCA試劑盒測定蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)。

1.3.3 光譜分析

1.3.3.1 紫外光譜

準確稱取10 mg蟲草多糖，用蒸餾水配制成0.5 g/L樣品溶液，用蒸餾水做空白對照，使用Shimadzu UV-1800光譜記錄CMP的紫外光譜。掃描范圍為190～400 nm，間隔1 nm。

1.3.3.2 傅里葉變換紅外光譜

按m(CMP)∶m(KBr)約為1∶50，研磨，然后壓制成1 mm薄片。采用Nicole IS10 FT-IR光譜儀(Thermo Electron，DTGS檢測器，美國)以4 000 cm-1分辨率記錄數(shù)據(jù)，掃描波數(shù)范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)為16次。

1.3.4 氣相色譜與質(zhì)譜(GC-MS)分析CMP單糖組成

單糖標(biāo)準品的預(yù)處理：分別準確稱取100 mg的阿拉伯糖、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、木糖溶于100 mL 50%的苯甲酸溶液，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

CMP的水解與還原：準確稱取10 mg多糖樣品于安瓿瓶中，加入0.5 mL H2SO4(12 mol/L)溶液后封管，35 ℃水浴1 h后加入2.5 mL超純水，100 ℃水浴1 h后冷卻至室溫得到水解樣品。取單糖標(biāo)準品和水解樣品各1 mL置于新管，加入2 g/L肌醇為內(nèi)標(biāo)，氨水調(diào)節(jié)溶液至堿性后再加入含200 g/L硼氫化鈉的氨水溶液0.2 mL，封管后水浴30 min (40 ℃)，加入0.3 mL乙酸漩渦振蕩。

單糖的衍生化：取還原后單糖樣品0.2 mL，加入乙酸酐和1-甲基咪唑混勻，室溫靜置10 min后加入超純水終止反應(yīng)。待樣品冷卻至室溫后加入二氯甲烷萃取衍生化后的單糖，保留下層有機相并加入無水硫酸鈉除去殘留的水分。離心后取上清液進行GC-MS分析。

色譜分析條件：使用配備氫火焰離子化檢測器的氣相色譜儀、毛細管柱(30 m×0.25 mm，Thermo ScientificTMTrace GOLD TG-5MS)。檢測器溫度：260 ℃，進樣口溫度：280 ℃，高純氦氣為載氣，氣體流速：1 mL/min，分流比40∶1，進樣量1.0 μL。升溫程序如下：50 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至150 ℃，再以1 ℃/min升至200 ℃，再以20 ℃/min升至280 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV，傳輸線溫度275 ℃，離子源溫度200 ℃，母離子m/z285，激活電壓1.5 V，質(zhì)量掃描范圍m/z33～550。

1.3.5 多角度激光光散射凝膠色譜聯(lián)用示差(GPC-MALLS-RI)分析蟲草多糖分子構(gòu)象

1.3.5.1 分析條件

MALLS光源：He-Ne激光源，波長633 nm，凝膠排阻色譜裝置配備示差折光檢測器(RI-2410，Waters，USA)和使用的P100型泵(1525 Binary HPLC Pump)。凝膠柱：UltrahydrogelTM2000 (7.8 mm×300 mm)。流動相為0.3 mol/L NaNO3溶液(用0.2 μm濾膜過濾除塵，并超聲脫氣)，流速0.5 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣體積：500 μL。多糖的折光指數(shù)增量(dn/dc)設(shè)定為0.147 cm3/g。光散射儀器的校準采用超純度甲苯。

1.3.5.2 樣品的處理

樣品配制質(zhì)量濃度：2 mg/mL(流動相預(yù)溶)并振蕩使其充分溶解后，過0.22 μm濾膜后進行GPC-MALLS-RI分析。

1.4 抗氧化活性的研究

1.4.1 DPPH自由基清除活性的測定

按照BLOIS[10]所述的方法測定CMP的DPPH自由基清除活性。簡單來說，將1.3.1中粗多糖和CMP溶于去離子水中配制成不同質(zhì)量濃度梯度(0.1～2.0 mg/mL)的樣品溶液。取1 mL DPPH無水乙醇溶液(0.125 mol/L)與1 mL樣品在室溫下避光劇烈振蕩30 min。用抗壞血酸(VC)作陽性對照，在517 nm處測定每個樣品的吸光度，按公式(1)計算粗多糖、CMP和VC的DPPH自由基清除率：

(1)

其中：A0，空白對照(無水乙醇代替樣品或者VC)的吸光值；A1，乙醇代替DPPH溶液的樣品或者VC的吸光值；A2，DPPH溶液與樣品或者陽性對照VC的吸光值。每個實驗重復(fù)3次。

1.4.2 ABTS自由基(ABTS+)清除活性的測定

按照WANG等[11]報道的方法，測定ABTS自由基的清除活性。將等體積的ABTS溶液(7 mmol/L)和過硫酸鉀(2.45 mmol/L)混合，在暗處儲存靜置16 h后，用無水乙醇稀釋30倍。取0.25 mL樣品溶液(0.1～2 mg/mL)加入到5 mL ABTS自由基體系中，在室溫避光反應(yīng)30 min后，在734 nm處測定吸光值。無水乙醇為空白對照，VC為陽性對照。按公式(2)計算粗多糖、CMP和VC的的ABTS自由基清除率：

(2)

其中：A0，空白對照(無水乙醇代替樣品或者VC)的吸光值；A1，乙醇代替ABTS溶液的樣品或者VC的吸光值；A2，ABTS溶液與樣品或者陽性對照VC的吸光值。每個實驗重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)除特殊說明外均采用平均值±標(biāo)準差(mean±SD)的形式表示，采用Astra軟件分析GPC-MALLS-RI數(shù)據(jù)，借助Xcalibur 1.2軟件分析GC-MS數(shù)據(jù)，其余作圖均采用Origin Pro軟件進行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 蟲草多糖的分離純化與定性分析

利用二乙氨基乙基纖維素52(DEAE-52)的吸附效應(yīng)，對蟲草多糖進行分離純化，洗脫曲線如圖1所示?？梢钥闯?，水洗蟲草多糖能夠得到2個峰(管28～41和管65～98)，本次實驗收集第2個峰頂部溶液，濃縮透析后進行冷凍干燥，并命名為蛹蟲草蟲草多糖CMP。

圖1 DEAE-52純化蟲草多糖洗脫曲線

Fig.1 The DEAE-cellulose 52 column chromatography elution curve of Cordyceps militaris polysaccharide

按照1.3.1的方法得到葡萄糖的標(biāo)準曲線，進行線性回歸后回歸方程為y=6.143 2-0.007 4(R2=0.999 3)；CMP質(zhì)量分數(shù)為(76.63±0.12)%。運用BCA試劑盒測定CMP蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為(2.98±0.06)%。相比蟲草粗多糖含量(44.95±0.07)%，DEAE-52柱層析法顯著地提高了多糖的質(zhì)量分數(shù)。

2.2 蟲草中性多糖(CMP)紫外和中紅外圖譜

圖2 蟲草中性多糖(CMP)紫外可見光譜圖

Fig.2 The UV-visible spectra of CMP

圖3 蟲草中性多糖(CMP)傅里葉變換紅外光譜圖

Fig.3 The FT-IR spectra of CMP

2.3 蟲草中性多糖(CMP)單糖組成

采用Xcalibur 1.2軟件對GC-MS單糖組成數(shù)據(jù)進行分析。通過與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(NIST1.6和Wiley 6.0)比對和與文獻中相應(yīng)化合物的Kovats指數(shù)(KI)比對進行化合物的定性。定量方法采用面積歸一法，以肌醇為內(nèi)標(biāo)。各種標(biāo)準單糖、CMP衍生物氣相色譜圖見圖4。根據(jù)它們的保留時間TR，確定組成單糖的種類，根據(jù)峰面積公式(3)計算出其摩爾比。

(3)

其中：i,標(biāo)準單糖;s,內(nèi)標(biāo)物;M,質(zhì)量;A,峰面積，求出各單糖相對校正因子fR。各單糖的摩爾比測定條件與校正因子相同，以肌醇為內(nèi)標(biāo)，得到各個單糖衍生物的峰面積與內(nèi)標(biāo)衍生物的峰面積比后乘以fR/M(M為相對分子質(zhì)量)，得到值之比即為各單糖摩爾比。

由圖4可知各標(biāo)準單糖對應(yīng)的保留時間分別為：鼠李糖(TR=31.30 min)、阿拉伯糖(31.88 min)、巖藻糖(32.21 min)、木糖(33.49 min)、甘露糖(48.74 min)、葡萄糖(49.50 min)、半乳糖(50.59 min)，TR=47.96 min的峰為肌醇。由圖4可知CMP中單糖組成為甘露糖、葡萄糖、半乳糖，摩爾比為1∶3.90∶1.51。

1-鼠李糖；2-阿拉伯糖；3-巖藻糖；4-木糖；5-內(nèi)標(biāo)-肌醇；6-甘露糖；7-葡萄糖；8-半乳糖)和蟲草多糖(CMP)乙酸酐咪唑衍生后的氣相色譜圖

圖4 單糖標(biāo)準品

Fig.4 The GC profile of monosaccharide standards

2.4 蟲草多糖(CMP)的分子量分布和構(gòu)象分析

2.4.1 分子量分布

通過多角度激光散射儀自帶Astra軟件采集數(shù)據(jù)，以時間為橫坐標(biāo)，多角度和示差響應(yīng)值為縱坐標(biāo)作圖得到圖5。由圖5可知，MALLS圖譜在洗脫時間在15～22 min范圍內(nèi)呈現(xiàn)出尖而瘦的峰，可以推測多糖的分子量相對比較均一。然而，對比RI圖譜發(fā)現(xiàn)，多糖的保留時間有了稍許的延遲，出峰時間段在16～22 min和22～35 min。為了確定多糖峰段，圖6表示了示差檢測蟲草多糖(CMP)分子質(zhì)量與時間的色譜圖。由圖可知22 min后多糖的分子量質(zhì)量趨近0，同時對比多次重復(fù)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RI檢測器均能夠采集22 min后的峰，從中可知22 min后出現(xiàn)的峰為溶劑峰。以上兩種檢測方式均能說明GPC-MALLS-RI能夠很好地檢測CMP的分子特性。

圖5 蟲草多糖(CMP)的90°激光峰色譜圖和示差圖

Fig.5 Chromatogram of CMP by LLS at 90°and differential refraction index

圖6 示差檢測蟲草多糖(CMP)分子質(zhì)量與時間的色譜圖

Fig.6 The chromatograms of the molecular mass vs. time detected by RI

早在1948年，ZIMM等人[14]提出光散射現(xiàn)象與分子量之間關(guān)系的理論，而后涌入了一大批科研工作者總結(jié)此理論，得到公式(4)和(5)[15]：

(4)

(5)

其中：K*為一個光學(xué)常數(shù)，與分子的折光指數(shù)增量和溶劑的折光指數(shù)相關(guān)；n，溶劑的折光指數(shù)；c，溶質(zhì)分子的質(zhì)量濃度(g/mL)；NA，阿佛加德羅常數(shù)；λ0，入射光的波長；dn/dc，溶液折射率與濃度變化的比值，它說明了隨溶質(zhì)濃度變化的溶液折光指數(shù)變化；R(θ)，不同角度光散射強度；Mw，重均分子量；A2為第二維里系數(shù)。而z平方根即為均方根半徑(radii of gyration,Rg)，也稱回轉(zhuǎn)半徑，此數(shù)據(jù)可以用來表征支化聚合物的尺寸。

將K*c/Rθ對sin2(θ/2)作圖，可得到著名的Zimm曲線(圖7)，擬合曲線線性關(guān)系式推算結(jié)果見表1，由擬合曲線截距的倒數(shù)得到CMP的重均分子摩爾質(zhì)量Mw為2.432×107g/mol，Mn為1.015×106，計算多糖分布指數(shù)d=Mw/Mn為2.396，處于2-3，屬于中等分布寬度樣品，此結(jié)果與圖7分子質(zhì)量分布范圍相吻合。同時通過擬合曲線的斜率開方得到Rg值為31.0 nm，一般來說，MALLS準確測定樣品均方根旋轉(zhuǎn)半徑Rg范圍為10～500 nm，這說明本次實驗誤差相對較小[16]。

表1 CMP的分子特征參數(shù)

注：表中數(shù)值表示為值(RSD%)，由統(tǒng)計軟件得出。

圖7 蟲草多糖(CMP)在0.3 mol/L NaNO3水溶液中(K*c/Rθ)c=0對角度的依賴關(guān)系圖

Fig.7 Angular dependence of (K*c/Rθ)c=0for the CMP in 0.3 mol/L NaNO3 aqueous solution

2.4.2 蟲草多糖(CMP)構(gòu)象

運用Astra軟件進一步得到均方根旋轉(zhuǎn)半徑Rg分布圖(圖8)?？梢钥闯觯肿恿康拇笮∨c均方根半徑(Rg)呈現(xiàn)正相關(guān)，也就是說隨著洗脫體積的增加，Rg有逐漸減小的趨勢，說明分子的形狀也在逐漸減小。

高分子聚合物的分子的形狀可以幫助我們更好地理解多糖的構(gòu)象信息，不論是多峰分布或者分布較寬的樣品，皆可以采用GPC-MALLS聯(lián)用系統(tǒng)測定分子量及分子回轉(zhuǎn)半徑得到分子的形狀。通過擬合曲線的斜率可以獲知分子的形狀。一般來說，斜率為0.33時，分子為球型，斜率為0.5～0.6時，分子為無規(guī)線團形狀，斜率為1時，分子為棒狀[17]。由圖8構(gòu)型判斷可知，兩者的線性關(guān)系較差，類似U型曲線，因此可以判斷其CMP在流動相溶液中為典型的高枝化度結(jié)構(gòu)。

圖8 蟲草多糖(CMP)分子旋轉(zhuǎn)半徑分布圖

Fig.8 The distribution diagram of molecular rotation radium

2.5 蟲草多糖(CMP)的抗氧化活性

目前DPPH自由基和ABTS自由基清除實驗已被廣泛用于評價功能成分的抗氧化作用。圖9和圖10繪制了CMP和VC對DPPH和ABTS自由基的清除活性的結(jié)果。從中可以看出CMP均表現(xiàn)明顯的DPPH和ABTS自由基清除活性，且清除能力呈現(xiàn)濃度依賴型趨勢。此外，CMP對DPPH自由基的清除效果略低于ABTS自由基，但是兩種評價方法的曲線顯著相似。

圖9 粗多糖、CMP和Vc的DPPH自由基清除率

Fig.9 The scavenging activity of crude polysaccharides,CMP and VC on DPPH radical

從圖9可以看出，當(dāng)質(zhì)量濃度為1 g/L時，粗多糖、CMP和VC的DPPH自由基清除率分別為39.81%、52.53%和95.81%。相比蟲草粗多糖，CMP的DPPH自由基清除率IC50值小于1 g/L，而粗多糖清除率的IC50大于2 g/L。圖10中ABTS自由基清除實驗也得到類似的結(jié)果。因此，CMP的抗氧化活性遠大于蟲草粗多糖。

圖10 粗多糖、CMP和Vc的ABTS自由基清除率

Fig.10 The scavenging activity of crude polysaccharides,CMP and VC on ABTS radical

3 結(jié)論

本研究首次采用GPC-MALLS-RI聯(lián)用技術(shù)，對經(jīng)DEAE-52分離純化得到的蟲草多糖分子量分布及均方根旋轉(zhuǎn)半徑等進行了探究，研究發(fā)現(xiàn)CMP質(zhì)量分數(shù)為76.63%，比粗多糖質(zhì)量分數(shù)提高70.48%。CMP的重均分子質(zhì)量為2.432×107g/mol，均方根半徑為31 nm，單糖組成甘露糖、葡萄糖和半乳糖，其摩爾比為1∶3.90∶1.51，且CMP的抗氧化活性大于粗多糖。本次研究可為進一步了解CMP的構(gòu)效關(guān)系提供理論支持和必要數(shù)據(jù)。當(dāng)然，本實驗缺少蟲草多糖分枝狀況和糖苷鍵構(gòu)型的分析，這部分內(nèi)容有待繼續(xù)研究。