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    全基因測序(WGS)在腸桿菌科細(xì)菌中的應(yīng)用研究

    2019-01-29 16:34:24周子超何嵐丁月平
    智慧健康 2019年2期
    關(guān)鍵詞:致病菌基因組測序

    周子超,何嵐,丁月平

    (1.浙江中醫(yī)藥大學(xué),浙江 杭州 310005;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院ICU,浙江 杭州 310005)

    0 引言

    全基因組測序(whole genome sequencing,WGS)是通過新一代的生物信息技術(shù),并結(jié)合新的模式識別方法和網(wǎng)絡(luò)分析,來分析不同機體基因組間的結(jié)構(gòu)差異手段來分析不同機體基因組間的結(jié)構(gòu)差異、單核苷酸的多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)和核心基因組多位點序列(core genome multilocus sequence typing,cgMLS)。具有信息全面、精確、高通量及高分辨率等優(yōu)點。且隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展,測序成本的大幅降低,WGS檢測技術(shù)得以迅速普及,并快速超越傳統(tǒng)策略,成為當(dāng)前群體進化、變異分析和功能基因挖掘的最主要研究策略,在細(xì)菌流行病學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。

    腸桿菌科細(xì)菌是臨床上常見的條件致病菌,可致肺炎、泌尿道感染、腹膜炎,菌血癥等疾病。隨著碳青霉烯類等抗菌藥物的廣泛和不合理應(yīng)用,細(xì)菌耐藥性普遍增加,甚至出現(xiàn)了碳青霉烯類耐藥,顯著增加了臨床治療的難度,耐藥菌的流行。因此,全面監(jiān)測該類細(xì)菌的致病性、耐藥機制和臨床流行病學(xué)具有重要的意義。

    本文將WGS在腸桿菌科細(xì)菌中的應(yīng)用作一綜述,以期為WGS在細(xì)菌流行病學(xué)中的應(yīng)用提供理論參考。

    1 全基因測序技術(shù)概況

    全基因組測序技術(shù)現(xiàn)階段應(yīng)用主要包括第二代測序技術(shù)(NPS)和第三代測序技術(shù)。在第一代測序技術(shù)(Sanger法)成本和速度發(fā)展至極限卻依然無法大規(guī)模應(yīng)用的情況下,第二代測序法應(yīng)運而生。2005年,454 Life sciences公司(現(xiàn)被Roche公司收購)首次基于焦磷酸測序法,以“邊合成邊測序”為核心,“片段-磁珠-讀長”的形式,達成了“超高通量”——能同時測序幾十萬到幾百萬條DNA分子,由此開辟了第二代測序技術(shù)的先河。隨著科技的不斷創(chuàng)新,2011年,第三代測序技術(shù)以單分子熒光、納米孔及實時記錄為技術(shù)核心,在原有的化學(xué)的間接性檢測基礎(chǔ)上融入顯微鏡觀察的直接性實時物理檢測,測序效率提升了2萬倍;在直接檢測與讀長增長的雙重條件下,結(jié)合更為先進的設(shè)備與熒光技術(shù),使得精確率高達99.9999%。

    綜上可知,每一代測序技術(shù)所基于的檢測(標(biāo)記)技術(shù)各不相同,即每一代誕生均為質(zhì)的改變。三代測序技術(shù)在研究應(yīng)用中不斷發(fā)展,尤其是第三代測序技術(shù),突破技術(shù)制約,使其在研究領(lǐng)域迅速普及,成為當(dāng)前細(xì)菌群體進化、變異分析和功能基因挖掘的最主要研究策略,并在細(xì)菌流行病學(xué)中得到了廣泛的應(yīng)用。

    2 WGS在腸桿菌科細(xì)菌中的應(yīng)用

    2.1 致病性研究及診斷應(yīng)用

    WGS具備高通量及高分辨率的特點,可更加精確、快速地應(yīng)用于體液檢測。因而WGS有望應(yīng)用于消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖泌尿系統(tǒng)等疾病的臨床致病機制及藥物靶點研究,從而為其診斷及后續(xù)治療提供新思路。

    大腸埃希菌、志賀菌、沙門菌均是常見的腸桿菌科類消化系統(tǒng)致病菌?;赪GS的應(yīng)用,研究發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌O157:H7的基因組變異主要歸因于某些噬菌體的動態(tài)性,使細(xì)菌菌株具有可變的毒力基因譜[1];揭示了志賀菌的毒力因子具有協(xié)同致病機制[2]。

    呼吸系統(tǒng)病原菌是醫(yī)院內(nèi)感染暴發(fā)的首要源頭,其中耐碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌(KPC-KP)更是臨床治療攻克的難關(guān)。全基因組測序讓KPC-KP的診斷和治療有了新的進展:現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了幾株毒力基因高頻率出現(xiàn)的分離株的基因序列[3];浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院余威團隊?wèi)?yīng)用WGS模擬技術(shù)證明了磷霉素聯(lián)合治療對大腸埃希菌的體外抗菌作用[4]。

    美國、英國、中國等各大醫(yī)院發(fā)現(xiàn)臨床WGS可快速揭示與臨床癥狀對應(yīng)的相關(guān)基因序列,極大地降低了診斷的假陰性率[5]。根據(jù)致病菌的基因序列的測定,提出診斷依據(jù),并做出療效評估,從而降低了醫(yī)院內(nèi)感染的發(fā)生率。

    與傳統(tǒng)的實驗室檢測手段相比,WGS可直接應(yīng)用于血流中殘存病原體DNA的檢測,直接從液體血培養(yǎng)中收集抗性基因[6],提供單種抗生素的敏感性測定及預(yù)測,避免了高抑制劑和人類細(xì)胞或DNA濃度對檢測設(shè)備及技術(shù)的限制;比較分離培養(yǎng)物和尿液標(biāo)本的WGS結(jié)果,直接從尿液中測序可以在多微生物樣品中進行細(xì)菌鑒定,可以在一些培養(yǎng)陰性的樣品中觀察到了其他可能的致病菌株。

    由于同一基因序列的可存在于多種菌株的全基因組序列中,利用WGS技術(shù)可以橫向研究含同一基因的致病菌的發(fā)病機制,能夠為臨床標(biāo)本提供相關(guān)信息,大大縮短診斷時間,相對延長治療的黃金時間窗。WGS從基因遺傳性層面出發(fā)探究病原體的致病機理,為疾病病因的診斷,新菌種致病性提供了新的理論依據(jù),在一定程度上降低了傳統(tǒng)檢測手段從形態(tài)、成分檢測上人為主觀因素影響造成的假陽性率和假陰性率,客觀地描述了致病菌的存在形式及所屬類別,同步提高了準(zhǔn)確度和可靠性。

    此外,為了克服數(shù)據(jù)分析的障礙,已有研究開發(fā)了一種公開提供的生物信息工具[7],這表明WGS已具備走出實驗室,應(yīng)用于臨床的條件。

    2.2 耐藥機制研究

    隨著抗生素的廣泛和不恰當(dāng)應(yīng)用及對醫(yī)院內(nèi)感染的逐步重視。使用全基因組測序儀對耐藥菌和標(biāo)準(zhǔn)菌中耐藥機制通路相關(guān)基因全序列及保守序列進行基因測序,計算機分析、識別已知基因與臨床耐藥相關(guān)的突變。由此,WGS可具象化挖掘出更罕見、多樣化的耐藥基因,提供多重耐藥菌基因型,并能夠準(zhǔn)確預(yù)測抗性表型,成為檢測細(xì)菌耐藥突變的寶貴工具。

    在近幾年間,針對各耐藥菌的測序已在發(fā)達國家快速開展:美國報告了第一個完全組裝的產(chǎn)志賀毒素的志賀菌多藥耐藥全基因組序列[8];湯姆·德曼報告了一種對所有26種抗生素都不敏感的肺炎克雷伯菌的基因組特征[9];西班牙的一種罕見的碳青霉烯酶類型(IMP-8)被WGS鑒定為陰溝腸桿菌分離株[10]。由此可見,以基因突變?yōu)榛A(chǔ)的耐藥菌產(chǎn)生機制,已經(jīng)可以從“基因?qū)用妗边@一源頭找到監(jiān)測措施,證明了監(jiān)測程序作為檢測編碼抗菌素耐藥性的意外基因的有效工具的實用性。

    面對多重耐藥基因,傳統(tǒng)分子研究技術(shù)需要分多次研究、拆分多個層次,從而不可避免的產(chǎn)生了針對性治療的局限性。WGS根據(jù)“化整為零”再“化零為整”的作用原理,可通過大規(guī)模并聯(lián)測序儀,同步對菌株實行全基因組序列多耐藥檢測,為后續(xù)的整體化治療奠定基礎(chǔ)。

    2.3 流行病學(xué)研究

    基于WGS的單核苷酸多態(tài)性分型和核心基因組多位點序列分型,通過全球同類致病菌基因的橫向比對,加速了致病菌來源的測定速度,可達到及時阻斷傳染源的傳播途徑,加速疫情控制的目的。

    有文獻顯示,近年英國多個地區(qū)應(yīng)用WGS技術(shù),迅速發(fā)現(xiàn)并切斷地中海、以色列等地的飲食來源致病菌的傳播途徑,有效地控制了腸道性疾病疫情的大規(guī)模暴發(fā)[11-12];通過對亞洲內(nèi)外六個國家分離的60株耐環(huán)丙沙星的沙門菌進行基因組測序,發(fā)現(xiàn)在南亞地區(qū)識別的以導(dǎo)致個體患病的致病菌很可能正在推動目前環(huán)丙沙星耐藥沙門菌的在洲際的激增[13]。在無性系和碳青霉烯酶基因的多樣性上證明,產(chǎn)碳青霉屬腸桿菌科在挪威地區(qū)的傳播依然有限,其感染主要與出國旅行有關(guān)[14]。

    與傳統(tǒng)分子追蹤技術(shù)相比,使用WGS進行的回顧性被動監(jiān)測在告知治療、識別區(qū)域流行病亞譜系方面具有實用價值,并為解釋前瞻性的、地方性的疾病提供一個框架?,F(xiàn)階段,美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)等共享數(shù)據(jù)庫中存在大約5200株肺炎克雷伯菌全基因組序列,這將有助于跟蹤這些致命性病原體的全球傳播[15],表明將WGS應(yīng)用于分子流行病學(xué)研究,可以更好地了解多藥耐藥菌株在世界范圍內(nèi)的傳播情況,并可作為發(fā)現(xiàn)和確定現(xiàn)有和新現(xiàn)致病菌的一個強有力的監(jiān)測工具。

    3 結(jié)語

    綜上所述,全基因組測序能對菌株的多重耐藥基因譜、毒力基因譜進行同步分析,可直接在體液中鑒定致病菌的血清型,并對其進行分子分型診斷研究。同時隨著該技術(shù)在腸桿菌科細(xì)菌檢測上的日漸成熟,已有公開的信息分析平臺用于全基因組序列分析檢測對照,成為了腸桿菌科全球防控的有力監(jiān)測工具。而在其他致病菌中推廣時也發(fā)現(xiàn),WGS現(xiàn)階段依舊存在基因譜構(gòu)建不全,適用范圍受限;技術(shù)成本高,生物信息分析標(biāo)準(zhǔn)化尚未實現(xiàn);未知突變序列無法解釋等不足。希望未來通過努力能將這一快速檢測分型方法盡快應(yīng)用于臨床診斷及疾病防控,提高患者疾病的治愈率,提升國民生活質(zhì)量。

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