基于網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合分子對接探究玉屏風散治療蕁麻疹的作用機制

武 燕，李春雨

安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校(安徽 蕪湖 241000)

蕁麻疹(Urticaria)是由于皮膚、粘膜小血管擴張及通透性增加而引起的一種局限性的水腫反應[1]，主要病理變化為真皮水腫，毛細血管及小血管擴張，淋巴管擴張及炎性細胞浸潤[2]。蕁麻疹在人群中的發(fā)病率達15%～20%，易反復發(fā)作。西醫(yī)學對于蕁麻疹的治療主要為抗組胺藥的對癥治療，其與組胺競爭效應細胞受體而緩解癥狀，但無法阻斷組胺釋放，且副作用明顯[3]。蕁麻疹在中醫(yī)屬于“隱疹”“風疹瘙癢”范疇，其基本病機為衛(wèi)氣不足，表虛不固，外感邪氣。玉屏風散是中醫(yī)扶正固表的名方，療效卓著，應用廣泛，是國家基本中成藥,由黃芪、白術、防風組成[4]。方中黃芪益氣固表為君，白術健脾益氣，助黃芪之功為臣，芪君術臣，使氣旺表固；防風祛風，固表而不留邪，主治氣虛表弱，易感風寒。現(xiàn)代中醫(yī)臨床將玉屏風廣泛用于蕁麻疹的治療，均取得較好的臨床療效[5]。藥理學研究表明玉屏風散對于調(diào)節(jié)免疫有較強作用，本研究通過網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合分子對接技術從分子層面探討玉屏風散治療蕁麻疹的作用機制。

1 資料與方法

1.1玉屏風散活性成分及潛在靶點的篩選在計算系統(tǒng)生物學實驗室平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/tcmsp.php)及化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm)中，分別搜索中藥黃芪(hedysarum multijugum maxim)、白術(atractylodes macrocephala koidz)、防風(saposhnikoviae radix)的活性成分及相關靶點信息，并依據(jù)藥動學吸收、分布、代謝、排泄(ADME)參數(shù)進行篩選，設置篩選條件為OB≥30%、DL≥0.18。將所有潛在靶點進行合并，剔除重復項，得到玉屏風散活性成分的潛在靶點。

1.2玉屏風散活性成分靶點預測在Uniport數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)中，借助Uniport KB功能檢索玉屏風散活性成分對應靶點相關的人類基因簡稱，獲得玉屏風散發(fā)揮治療作用可能的基因靶點。

1.3蕁麻疹相關疾病靶點預測分別在GeneCards、OMIM、Drugbank、PharmGKB、Therapeutic Target Database數(shù)據(jù)庫中以urticaria為關鍵詞檢索相關的基因靶點。

1.4構建藥物-活性成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡通過VennDiagram軟件取藥物與疾病基因靶點交集，得到藥物發(fā)揮治療作用可能的基因靶點。通過用Cytoscape3.7.0構建藥物-活性成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡關系圖。

1.5構建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(PPI)并分析核心基因?qū)⒂衿溜L散對蕁麻疹發(fā)揮治療作用可能的基因靶點輸入String 11.0系統(tǒng)，構建PPI網(wǎng)絡，設置置信區(qū)間為highest confidence=0.700，提高數(shù)據(jù)的可靠性。

對PPI網(wǎng)絡進行拓撲學特征分析，通過Cytoscape的插件CytoNCA計算參數(shù)來評價網(wǎng)絡中每個節(jié)點在功能上的重要性，以中間中心性(BC)、接近中心性(CC)，度中心性(DC)、特征向量中心性(EC)、局部平均連通性方法(LAC)、網(wǎng)絡中心性(NC)為參數(shù)對網(wǎng)絡節(jié)點進行評分分析，篩選核心基因。

1.6核心基因的生物學過程及通路分析利用R語言的clusterProfiler軟件包對核心基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，以pvalue<0.05為納入標準。對pvalue值最小的前30條通路繪制柱狀圖。

1.7分子對接選取PPI網(wǎng)絡中的核心基因進行分子對接驗證。在PubChem數(shù)據(jù)庫檢索玉屏風散對蕁麻疹發(fā)揮治療作用可能的活性成分的3D結(jié)構。在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)搜索PPI網(wǎng)絡中核心基因的靶蛋白，并下載其3D結(jié)構，保存為PDB文件。利用PyMOL軟件對核心基因的靶蛋白結(jié)構進行去除水分子及小分子配體的處理，保存其構象文件。利用AutoDockTools軟件對靶蛋白及藥物活性成分的分子結(jié)構進行加氫、計算電荷等處理，并轉(zhuǎn)換為PDBQT格式文件。以靶蛋白原型配體所在位置為中心確定活性口袋，設置參數(shù)size_x=40,size_y=40,size_z=40,spacing=1.0。利用AutoDock Vina 1.1.2軟件進行分子對接，利用PyMOL軟件對結(jié)合能最低的對接結(jié)果進行繪圖分析。

2 結(jié)果

2.1玉屏風散活性成分及潛在靶點通過初步檢索，得到黃芪活性成分20個，白術活性成分7個，防風活性成分18個，見表1。潛在靶點黃芪953個；白術774個，防風1 946個，剔除重復項，得到玉屏風散活性成分的潛在靶點共計723個。通過Uniport數(shù)據(jù)庫，檢索活性成分相對應的人類基因靶點共194個。

表1 玉屏風散有效生物活性成分

續(xù)表1

2.2蕁麻疹相關疾病靶點預測以urticaria為關鍵詞進行檢索，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到疾病相關基因靶點1 007個，OMIM數(shù)據(jù)庫中檢索到疾病相關基因靶點1個，Drugbank數(shù)據(jù)庫中檢索到疾病相關基因靶點57個，PharmGKB數(shù)據(jù)庫中檢索到疾病相關基因靶點1個，Therapeutic Target Database數(shù)據(jù)庫中檢索到疾病相關基因靶點5個。將所有疾病相關基因靶點取并集，共得到蕁麻疹相關基因靶點1 071個。

2.3構建藥物-活性成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡通過VennDiagram軟件取藥物與疾病基因靶點交集，得到玉屏風散治療蕁麻疹潛在的基因靶點86個。通過用Cytoscape3.7.0構建藥物-活性成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡關系圖,顯示玉屏風散治療蕁麻疹相關的活性成分33個，其中對應的基因靶點數(shù)目最多的6個活性成分依次是槲皮素(MOL000098，quercetin)66個，山奈酚(MOL000422，kaempferol)28個，漢黃芩素(MOL000173，wogonin)22個，β-谷甾醇(MOL000358，β-sitosterol)16個，芒柄花黃素(MOL000392，formononetin)14個，異鼠李素(MOL000354，isorhamnetin)9個，見圖1。

圖1 藥物-活性成分-靶基因-疾病(Urticaria)網(wǎng)絡關系圖

2.4構建PPI網(wǎng)絡并分析核心基因?qū)?.3中得到的基因靶點導入String數(shù)據(jù)庫，構建玉屏風散治療蕁麻疹可能基因靶點的PPI網(wǎng)絡圖，見圖2。

圖2 玉屏風散治療蕁麻疹基因靶點的蛋白質(zhì)PPI

利用Cytoscape 3.7.0軟件的CytoNCA插件對PPI網(wǎng)絡中的靶點進行拓撲學分析，設置過濾條件BC、CC、DC、EC、LAC、NC 6項評分均大于中位值。經(jīng)過兩次分析篩選，得到PTGS2、VEGFA、ICAM1、EGF、MMP9、IL4、CXCL8等11個核心基因靶點，見圖3。

圖3 玉屏風散對蕁麻疹發(fā)揮治療作用的核心基因靶點

2.5核心基因的生物學過程及通路分析GO富集分析結(jié)果顯示生物過程主要涉及氧化應激反應(response to oxidative stress)、活性氧代謝過程(reactive oxygen species metabolic process)等，細胞組分主要涉及細胞膜膜筏(membrane raft)、細胞膜微結(jié)構域(membrane microdomain)等，分子功能涉及細胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)等，見圖4。

對86個靶點基因進行KEGG富集分析，P值排名靠前的主要有PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路(Fluid shear stress and atherosclerosis)等，見圖5。

2.6分子對接分子對接結(jié)果顯示，槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)、漢黃芩素(wogonin)等11個有效成分與對應基因靶點有較好的結(jié)合活性。其中，槲皮素通過氨基酸PHE-250與基因靶點MMP9結(jié)合，結(jié)合能為-11.0 kcal/mol；芒柄花黃素通過氨基酸TYR-136、LYS-468與基因靶點PTGS2結(jié)合，結(jié)合能為-9.6 kcal/mol；漢黃芩素通過氨基酸LYS-137、PRO-153、GLY-135與基因靶點PTGS2結(jié)合，結(jié)合能為-9.6 kcal/mol；槲皮素通過氨基酸ARG-645、GLY-613、ASP-611與基因靶點AKT12結(jié)合，結(jié)合能為-6.3 kcal/mol?？梢暬治鲆妶D6-9。

圖8 漢黃芩素-PTGS2分子對接模式圖(Affinity=-9.0 kcal/mol)

圖9 槲皮素-AKT12分子對接模式圖(Affinity=-6.3 kcal/mol)

分子對接虛擬技術顯示，化合物均穩(wěn)定位于對接口袋內(nèi)，槲皮素在活性位點周圍與氨基酸PHE-250形成氫鍵結(jié)合MMP9；芒柄花黃素在活性位點周圍與氨基酸TRY-136、LYS-468形成氫鍵、碳鍵結(jié)合到PTGS2；漢黃芩素在活性位點周圍與氨基酸LYS-137、GLY-135、PRO-153形成氫鍵、氧鍵結(jié)合到PTGS2；槲皮素在活性位點周圍與氨基酸ARG-645、GLY-613、ASP-611氫鍵結(jié)合到AKT12。

3 討論

本研究得到玉屏風散活性成分45個，通過構建藥物-活性成分-靶基因-疾病網(wǎng)絡，篩選出其治療蕁麻疹可能的活性成分33個，其中對應的基因靶點數(shù)目最多的依次是槲皮素，山奈酚，漢黃芩素，β-谷甾醇，芒柄花黃素，異鼠李素等6個活性成分，均具有抗炎、抗氧化應激、調(diào)節(jié)免疫等功能，是治療蕁麻疹的關鍵活性物質(zhì)。研究表明[6-9]槲皮素可以通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路下調(diào)炎癥因子IL-1β、TNF-α等的表達發(fā)揮抗炎作用；槲皮素在體內(nèi)可以提高一氧化氮水平和外周血總抗氧化能力，并保護血管內(nèi)皮[10-11]，在體外可以清除超氧陰離子、羥自由基、單線態(tài)氧等氧自由基而發(fā)揮抗氧化應激作用[12-13]。山奈酚通過抑制COX-2、PGE2、MMP9等炎性因子的釋放而發(fā)揮抗炎作用[14]。漢黃芩素可降低炎癥因子IL-6、IL-8和趨化因子MCP-1的釋放，減輕炎癥反應[15-16]。β-谷甾醇可抑制組胺、PEG2、緩激肽等炎癥介質(zhì)活性，降低毛細血管通透性而抗炎[17]；通過清除氧自由基，并維護細胞膜結(jié)構的穩(wěn)定而發(fā)揮抗氧化應激作用[18]；通過降低TSLP的水平來降低過敏反應造成的皮膚細胞損傷[19]。芒柄花黃素可下調(diào)雌激素樣受體水平，改善人體內(nèi)分泌微環(huán)境而提高免疫力[20]，還可以提高抗氧化超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化酶、過氧化氫酶的活性，減少氧自由基的生成，通過清除有害的氧自由基，繼而提高機體的抗氧化應激能力[21]。異鼠李素可以上調(diào)Nrf2-ARE信號通路增加抗氧化酶的表達而發(fā)揮抗氧化應激的作用[22]。

通過對PPI網(wǎng)絡核心基因分析，玉屏風散治療蕁麻疹的關鍵基因靶點有PTGS2、VEGFA、ICAM1、EGF、MMP9、IL4、CXCL8等11個。PTGS2是前列腺素內(nèi)過氧化物合酶的一個亞型，為膜整合蛋白，可在多種因素誘導下產(chǎn)生和釋放前列腺素從而調(diào)節(jié)炎癥反應。VEGFA屬于血管內(nèi)皮生長因子，在缺氧狀態(tài)下可誘發(fā)氧化應激反應并引起血管通透性增加。ICAM1是細胞表面誘導性糖蛋白，與特異性受體結(jié)合可增強內(nèi)皮細胞及炎性細胞的粘附，誘發(fā)炎癥反應。EGF為表皮生長因子，其依賴PI3K-Akt信號通路可降低IL-6、IL-1β等前炎性因子的釋放及下調(diào)CCL2、CCL5及CXCL10等趨化因子的表達，在皮膚細胞中表現(xiàn)尤為明顯[23]。IL-4對于B細胞、T細胞、肥大細胞、巨噬細胞和造血細胞均有免疫調(diào)節(jié)作用，IL-4基因多態(tài)性與蕁麻疹、哮喘、過敏性鼻炎等多種免疫失調(diào)性疾病密切相關[24]。MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶，對CXCL8、VEGFA具有調(diào)節(jié)作用而參與炎性反應[25]。以上表明，蕁麻疹是免疫系統(tǒng)失調(diào)而誘發(fā)的皮膚細胞出現(xiàn)氧化應激及炎性反應的疾病。

GO富集分析顯示，玉屏風散治療蕁麻疹可能通過調(diào)節(jié)氧化應激反應、脂多糖的反應等生物過程，干預相關細胞因子受體結(jié)合等分子功能而發(fā)揮抗炎、抗氧化應激、調(diào)節(jié)免疫的作用。KEGG富集分析顯示，玉屏風散治療蕁麻疹的關鍵靶點富集于PI3K-Akt信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路等炎性反應、氧化應激、血管內(nèi)皮細胞等信號途徑上。PI3K-Akt信號通路是細胞信號傳導的重要通路，通過多種效應調(diào)節(jié)細胞基本功能，其表達上調(diào)可激活淋巴細胞增殖分化而發(fā)生免疫失調(diào)。AGE-RAGE信號通路在免疫球蛋白RAGE受體誘導下可以促進氧化自由基的形成而誘發(fā)氧化應激反應。流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞中的炎癥因子、VCAM-1和ICAM-1調(diào)控炎癥反。

分子對接結(jié)果顯示，槲皮素、芒柄花黃素、β-谷甾醇、漢黃芩素等化合物與PTGS2、EGF、MMP9、AKT12等對應基因靶點均有較好的結(jié)合活性，它們可能是玉屏風散治療蕁麻疹潛在的活性成分。

綜上所述，網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合分子對接研究顯示玉屏風散的多種活性成分通過多靶點、多通路、相互協(xié)同的復雜機制調(diào)節(jié)人體免疫功能，降低皮膚細胞的炎性反應及氧化應激反應從而對蕁麻疹發(fā)揮治療作用。鑒于目前醫(yī)學對蕁麻疹的發(fā)病機制的認識仍存在不足，網(wǎng)絡藥理學的研究方法有其局限性，后期還需要進一步的實驗研究來探討玉屏風散治療蕁麻疹的作用機制。