基因編輯技術(shù)在細(xì)胞治療中的研究進(jìn)展

朱碧云 李林夕 王立人 李大力

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)疾病的易感性都與DNA的變異相關(guān)，其中最為典型的例子就是通常所說的遺傳疾病，特別是單基因遺傳病。在已知的6000多種遺傳病中，目前只有大約5%的疾病可以通過定期服用小分子藥物或酶替代療法進(jìn)行治療，超過 95%的病種沒有有效的治療方案，治愈更是無從談起。上世紀(jì)60年代提出了基因治療概念，希望通過導(dǎo)入治療性基因藥物來治愈由于基因缺陷而造成的疾病，為遺傳疾病的治療帶來了希望，特別是單基因突變造成的遺傳病 [https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/]。經(jīng)典的基因治療主要有兩種策略：在體（in vivo）基因治療和離體（ex vivo）細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療。前者是直接利用遞送載體（主要分為重組病毒載體和非病毒遞送載體）將基因藥物進(jìn)行局部注射或者靜脈注射導(dǎo)入到靶器官進(jìn)行表達(dá)而彌補(bǔ)缺陷基因的功能；后者主要是將患者的細(xì)胞（一般是成體干/祖細(xì)胞、以CAR-T細(xì)胞療法為代表的免疫細(xì)胞或者極具應(yīng)用前景的 iPS細(xì)胞）分離培養(yǎng)，同時進(jìn)行基因操作以修復(fù)患者細(xì)胞的遺傳缺陷，再通過自體回輸來進(jìn)行治療。

通過數(shù)十年的努力，基因治療在最近幾年獲得了突破性的進(jìn)展。截止到 2018年，全球已經(jīng)開展了2600多項基因治療的臨床研究，共有7個基因治療藥物分別在中國、美國和荷蘭等國家獲批：4個用于腫瘤治療（2個溶瘤病毒：英文名為Oncorine和T-VEC；2個CAR-T細(xì)胞療法：Kymriah和 Yescarta）、3個用于遺傳疾病治療（治療脂蛋白脂肪酶突變的Glybera，治療腺苷脫氨酶突變造成重癥聯(lián)合免疫缺陷的Strimvelis以及治療REP65基因突變造成先天性黑矇癥的Luxtuma）。Strimvelis、Kymriah和 Yescarta這 3個藥物都是通過離體細(xì)胞治療的方式分別將基因藥物整合到患者造血干細(xì)胞和T細(xì)胞再自體回輸，可見細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療策略非常成功。細(xì)胞治療相對于體內(nèi)治療顯著的優(yōu)勢在于可離體編輯靶細(xì)胞群，用可編程核酸酶修飾后可將校正后的細(xì)胞移植回原始宿主中。這種治療模式可以利用多種基因藥物的遞送體系來對靶細(xì)胞進(jìn)行基因操作，例如電穿孔、陽離子脂質(zhì)、細(xì)胞穿透肽和病毒載體。這些導(dǎo)入方式與直接導(dǎo)入體內(nèi)的在體療法相比具有更高的效率，同時體外基因操作的干細(xì)胞具有可培養(yǎng)和傳代擴(kuò)增優(yōu)勢，能進(jìn)一步地富集所需的陽性細(xì)胞，有效提高治療效率。許多離體治療可以控制所遞送的治療分子的特定劑量，從而減少核酸酶的脫靶修飾。離體細(xì)胞的純化、培養(yǎng)和移植等專業(yè)技術(shù)的長足發(fā)展也為細(xì)胞治療提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。目前來說，獲批的幾個基因治療產(chǎn)品無一例外都是通過重組病毒作為遞送載體，不可避免地出現(xiàn)兩個方面的擔(dān)憂：一是非整合型病毒表達(dá)基因藥物時效性不夠長而整合型病毒會將外源基因隨機(jī)插入到受體細(xì)胞的基因組中，另一個是可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。最理想的策略是將基因藥物精確整合到基因組的特定位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)長時間穩(wěn)定表達(dá)。由于腫瘤基因治療的特殊性以及本期有專文討論CAR-T細(xì)胞療法的進(jìn)展，本文主要圍繞基因編輯介導(dǎo)的離體細(xì)胞治療的研究進(jìn)展進(jìn)行回顧和展望。

1 基因編輯進(jìn)展概述

近年來，隨著多種人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)的出現(xiàn)，高效的基因編輯技術(shù)得到了快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)主要包括4種：大范圍核酸酶技術(shù)（meganuclease）、鋅指核酸酶技術(shù)（zinc finger nuclease，ZFN）、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶技術(shù)（transcription activator-like effector nuclease，TALEN）和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR 相關(guān)蛋白 （ CRISPR-associated proteins，Cas）系統(tǒng)。通過人工核酸酶可以精確靶向雙鏈 DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂（double strand break，DSB）。DSB促使細(xì)胞啟動兩種主要的DNA損傷修復(fù)機(jī)制：非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源重組（homology-directed repair，HDR）。NHEJ可以發(fā)生在細(xì)胞周期的任一時期，是最主要的高效修復(fù)方式，但是由于通過NHEJ精確修復(fù)（canonical non-homologousend joining，C-NHEJ）的 DNA 序列會再次被核酸酶切割，所以最終會出現(xiàn)不同長度片段（主要是少數(shù)幾個堿基）的插入、刪除或替換（insertion/deletion/substitution，indel），從而導(dǎo)致基因失活（alternativenon homologous end joining，A-NHEJ）。HDR是一種精確但低效的修復(fù)方式，在有同源序列作為重組模板的前提下僅發(fā)生于細(xì)胞周期的 S/G2期?；贑RISPR/Cas9技術(shù)，將胞嘧啶脫氨酶或者腺苷脫氨酶與 Cas9缺口酶（Cas9-nickase，Cas9n）融合，產(chǎn)生了單堿基編輯（base editing）技術(shù)。單堿基編輯技術(shù)直接利用脫氨酶將堿基脫氨通過DNA復(fù)制精確引入堿基替換，最大的優(yōu)勢是效率高，不依賴于同源重組也極少引起indel，有著更安全的特點(diǎn)，具有非常大的應(yīng)用潛力。與此同時，隨著科學(xué)家對基因編輯工具認(rèn)識的不斷加深和改造，基因編輯工具的應(yīng)用領(lǐng)域也從基因組編輯發(fā)展到了表觀基因組編輯和轉(zhuǎn)錄組調(diào)控領(lǐng)域，開發(fā)出一系列表觀基因組編輯工具和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)工具。這些工具展示了基因編輯技術(shù)的超強(qiáng)可塑性，增加了更多的應(yīng)用場景，也在基因治療中展現(xiàn)了無可比擬的優(yōu)勢。

2 細(xì)胞治療中多種基因編輯策略的應(yīng)用

經(jīng)典的基因治療只能將外源基因添加到細(xì)胞中，通過過表達(dá)基因產(chǎn)物達(dá)到治療的效果?；蚓庉嫾夹g(shù)則更加靈活，可以通過定點(diǎn)整合來修復(fù)突變基因或者過表達(dá)治療性基因產(chǎn)物，可以刪除基因編碼區(qū)部分序列達(dá)到基因失活的效果，還能作用于基因的啟動子序列來增強(qiáng)或者減弱基因表達(dá)。體內(nèi)基因編輯治療的基礎(chǔ)研究進(jìn)展較快，例如通過同源重組在肝臟中原位修復(fù)致病突變，治愈I型酪氨酸血癥（hereditary tyrosinaemia type I，HT-I）、B 型血友病和致命性高血氨癥；通過在耳蝸毛細(xì)胞中敲除TMC1致病性的雜合突變等位基因而保留正常的等位基因，恢復(fù)模型小鼠聽力；通過基因編輯刪除dystrophin基因中提前出現(xiàn)終止密碼子的外顯子區(qū)段，在小鼠和狗中顯著改善杜氏肌營養(yǎng)不良癥（Duchenne muscular dystrophy，DMD）的癥狀。

然而，在體基因治療也只能針對部分疾病，對于體內(nèi)病毒感染效率非常低的造血干細(xì)胞等束手無策，而且包括我們課題組在內(nèi)的研究均發(fā)現(xiàn)即便是體內(nèi)AAV感染效率最高的肝細(xì)胞，在成年動物中通過同源重組修復(fù)單個堿基突變的效率都低于5%，通常只有2%以下。而離體細(xì)胞治療的方法可以高效感染造血干細(xì)胞，例如2018年4月，《The New England Journal of Medicine》雜志上發(fā)表了一項關(guān)于 β-地中海貧血癥（β-thalassemia，簡稱β地貧）治療的重要成果。研究者從患者體內(nèi)提取出 CD34+造血干細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)染LentiGlobin BB305慢病毒載體導(dǎo)入可編碼成人血紅蛋白 β-鏈的HbAT87Q基因，再重新回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，實(shí)現(xiàn)患者紅細(xì)胞中正常β珠蛋白的高表達(dá)，這項基于自體細(xì)胞的基因療法，最終減輕了患者的貧血癥狀和輸血依賴。值得注意的是，其減少輸血依賴的有效率達(dá)100%，并且在之后的隨訪中，經(jīng)治療的22例患者的長期輸血需求明顯減少，或已完全不需要輸血，該療法并沒有帶來明顯的副作用。

離體細(xì)胞治療還可以在體外擴(kuò)增或富集有效導(dǎo)入的陽性干細(xì)胞，提高治療成功率。例如，2017年，Michele De Luca課題組報道了通過自體移植轉(zhuǎn)基因表皮干細(xì)胞，在一個患有嚴(yán)重交界型大皰性表皮松解癥（Junctional Epidermolysis Bullosa，JEB）的7歲兒童身上修復(fù)了80%左右的表皮。通過從病人中分離表皮干/祖細(xì)胞，將正常的LAMB3基因通過逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入患者細(xì)胞，形成穩(wěn)定感染的克隆后在體外擴(kuò)增形成類似于表皮的結(jié)構(gòu)再進(jìn)行自體移植。這些細(xì)胞形成上皮組織可永久性地恢復(fù)大量皮膚的缺陷。這些通過逆轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒直接導(dǎo)入外源基因的傳統(tǒng)基因療法在臨床上取得了巨大的成功，說明基于細(xì)胞的基因治療在很多疾病治療方面有著巨大優(yōu)勢，但是傳統(tǒng)方法采用的慢病毒導(dǎo)入方式有著隨機(jī)整合的致瘤風(fēng)險，因此需要新的策略實(shí)現(xiàn)高效精確整合。下面將圍繞不同的基因編輯策略探討其在細(xì)胞治療中的應(yīng)用及進(jìn)展。

2.1 利用NHEJ的基因編輯治療思路

通常情況下，由于NHEJ修復(fù)往往造成單個或多個堿基的插入或缺失，常常用于破壞正常的基因閱讀框，使基因失活。利用這一策略最為成功的例子是人們可通過ZFN在T細(xì)胞中敲除HIV共受體之一的CCR5基因進(jìn)行艾滋病的治療。在歐洲有部分人CCR5基因編碼區(qū)第185位氨基酸密碼子以后發(fā)生了32個堿基缺失導(dǎo)致基因失活，這些人對HIV-1病毒有天然的免疫力。2007年，Brown在德國一家醫(yī)院接受天然CCR5突變的造血干細(xì)胞移植進(jìn)行白血病治療，同時他體內(nèi)的HIV病毒也完全消失了，成為世界上首例被“治愈”的艾滋病患者。受此鼓舞，研究者在前期研究中分別在人CD4+T細(xì)胞和造血干/祖細(xì)胞利用ZFN破壞CCR5基因，編輯效率分別為 50%和 17%。將編輯后的細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠中，用HIV-1病毒攻擊可以進(jìn)一步富集CCR5基因缺失的細(xì)胞，證明了該療法的可行性。在此基礎(chǔ)上，研究者將12名HIV-1感染者的T細(xì)胞分離出來，利用ZFN對CCR5的編碼區(qū)進(jìn)行編輯，細(xì)胞體外擴(kuò)增后，每位患者一次性注入 100億個T細(xì)胞（CCR5編輯效率為11%～28%）。隨機(jī)分組的6名患者在自體T細(xì)胞移植4周后開始停止服用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，其中4名患者12周檢測時病毒數(shù)量顯著減少。該研究是第一個利用基因編輯進(jìn)行疾病治療的臨床研究，從概念上證明基因編輯用于基因治療的安全性和有效性，具有劃時代的意義。然而也可以看到 ZFN的基因編輯效率比較低，這主要是ZFN本身編輯活性有限，另外T細(xì)胞和造血干細(xì)胞的基因遞送難度較大。該研究中所用的質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)和腺病毒遞送都不能達(dá)到很高的效率。最近 Alexander Marson實(shí)驗室利用CRISPR/Cas9在CD4+T細(xì)胞中使 CCR5的表達(dá)量下降了近80%，并有效阻止了HIV-1病毒衣殼的感染。

NHEJ除了可以用來破壞基因的編碼框，也可以作用于啟動子、增強(qiáng)子等非編碼序列，抑制或者激活目的基因的表達(dá)，達(dá)到治療的效果。β地貧是臨床上常見的遺傳性血液病之一，其病因是β珠蛋白基因的突變，導(dǎo)致本應(yīng)與其結(jié)合形成成人血紅蛋白（adult hemoglobin，HBA）的 α珠蛋白在紅細(xì)胞前體中不斷積累使紅細(xì)胞前體過早凋亡。若能重新開啟人體中被沉默的γ珠蛋白（主要在胎兒期表達(dá)，出生后表達(dá)被沉默）表達(dá)則能夠使游離的α珠蛋白與γ珠蛋白形成胎兒血紅蛋白（fetal hemoglobin，HBF），達(dá)到治療 β地貧的目的。BCL11A正是負(fù)責(zé)沉默 γ珠蛋白的主要轉(zhuǎn)錄抑制因子，由于BCL11A基因在造血干細(xì)胞中有著關(guān)鍵作用，不能直接敲除。2015年哈佛醫(yī)學(xué)院Dan E. Bauer研究小組與麻省理工學(xué)院的張峰研究組合作，利用 CRISPR/Cas9技術(shù)在紅細(xì)胞前體細(xì)胞系HUDEP2中篩選得到了一個BCL11A的紅系特異性增強(qiáng)子。和預(yù)期的一樣，在利用CRISPR/Cas9技術(shù)破壞該增強(qiáng)子后，BCL11A在紅細(xì)胞前體中的表達(dá)大大降低，而γ珠蛋白的表達(dá)以及HBF的含量則大大提高，造血干細(xì)胞的正常紅系和多能分化功能并未受到影響。由于造血干細(xì)胞的分離和移植技術(shù)已經(jīng)很成熟，在分離后的造血干細(xì)胞中敲除BCL11A增強(qiáng)子，隨后重新移植入患者體內(nèi)就有可能治愈或緩解患者的病情。而就在一年后來自St Jude兒童醫(yī)院的Mitchell J Weiss研究組再次將治療β珠蛋白類突變疾病的理想向前推進(jìn)了一步，與Dan E. Bauer研究組不同的是，他們將 CRISPR/Cas9的靶點(diǎn)直接指向了γ珠蛋白的啟動子-102～-104區(qū)域。有研究表明，該區(qū)域為BCL11A的結(jié)合位點(diǎn)，臨床上發(fā)現(xiàn)如果該區(qū)域發(fā)生缺失同樣能夠?qū)е?γ珠蛋白升高[即高胎兒血紅蛋白癥（heterocellular hereditary persistence offetal hemoglobin，HPHF）]。Weiss研究組在鐮刀狀貧血（sickle cell disease，SCD，該疾病同樣是β珠蛋白突變導(dǎo)致的）病人的造血干祖細(xì)胞中針對-102～-104區(qū)域利用 Cas9進(jìn)行編輯后發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)產(chǎn)生的病態(tài)鐮刀狀細(xì)胞比例由20%以上降低到了個位數(shù)比例。以上兩項研究對β地貧和鐮刀狀貧血的治療有著巨大的意義，相關(guān)的臨床研究（Clinical-Trials.gov Identifier：NCT03655678）也已經(jīng)被開展。

利用基因編輯工具在相近的基因組區(qū)域產(chǎn)生兩個DSB。NHEJ修復(fù)過程中還可能將兩個DSB區(qū)間的DNA序列倒位后再連接起來，可以針對由于倒位而產(chǎn)生的遺傳疾病。來自法國染色質(zhì)和基因發(fā)育調(diào)控實(shí)驗室Annarita Miccio研究組的研究表明，在造血干/祖細(xì)胞中，利用CRISPR/Cas9敲除δ與β珠蛋白基因間 13.6 Kb或使其倒位也可以重新激活胎兒血紅蛋白的表達(dá)。類似地，來自韓國的Jin-Soo Kim的研究小組在兩篇報道中分別利用 TALEN和CRISPR/Cas9技術(shù)在 iPS細(xì)胞中成功修復(fù)了140 KbDNA和600 Kb倒位的A型血友病細(xì)胞模型，這些修復(fù)后的 iPS細(xì)胞在分化成內(nèi)皮細(xì)胞并進(jìn)行皮下移植后成功緩解了 A型血友病模型小鼠的疾病癥狀。

總的來說，雖然ZFN、TALEN和 CRISPR/Cas9理論上都適用于基于 NHEJ的細(xì)胞治療，但是CRISPR/Cas9系統(tǒng)僅需根據(jù)不同位點(diǎn)設(shè)計相應(yīng)的 sgRNA，更加簡單靈活而高效，所以在 CRISPR/Cas9技術(shù)出現(xiàn)以后越來越多的相關(guān)領(lǐng)域的研究開始轉(zhuǎn)向利用 CRISPR/Cas9系統(tǒng)。特別是對于需要產(chǎn)生多個 DSB的治療模型，利用 CRISPR/Cas9技術(shù)只需遞送多個577sgRNA，非常簡便。而反觀利用 ZFN或者 TALEN的方法都需要多遞送1對或多對核酸分子，增加了遞送成本和難度，也大大降低了同時編輯的效率。

2.2 利用 HDR的基因編輯治療思路

在大多數(shù)由基因突變導(dǎo)致的疾病當(dāng)中，仍然需要通過精準(zhǔn)的基因修復(fù)或者在安全位點(diǎn)（例如，AAVS1基因座）插入正常的基因才能夠?qū)崿F(xiàn)基因治療，此時利用DSB來提高HDR就變得意義重大。來自Sangamo公司的 Wang等通過電轉(zhuǎn)將ZFN-mRNA遞送到HSPC后再利用 AAV6病毒遞送供體模板，成功地將GFP基因分別插入到了CCR5和AAVS1位點(diǎn)中，效率分別達(dá)到了17%和26%，而在胎肝來源的HSPC中效率更是高達(dá)19%和43%。而此前僅利用IDLV（integration deficient lenti virus）作為供體的定點(diǎn)整合效率只有0.1%。利用類似的手段，來自Sangamo公司的Kang研究組等在慢性肉芽腫病人來源的HSPC中，將治療性的gp91phox基因成功地特異性整合到AAVS1基因座，效率約為7.1%。NSG小鼠移植模型證明了長期再生性造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（long term repopulating HSPC）的確得到了正確的基因插入，為治療人類血液和免疫系統(tǒng)疾病提供了新的思路。DeWitt等則通過優(yōu)化包含Cas9蛋白和 sgRNA的核糖核蛋白（RNP）復(fù)合物來遞送CRISPRCas9系統(tǒng)，利用單鏈 DNA寡核苷酸（ssODN）作為供體修復(fù)SCD突變，精確修復(fù)的效率高達(dá) 33%，經(jīng)校正的 HSPC產(chǎn)生了較少的鐮狀血紅蛋白RNA和蛋白質(zhì)，并且當(dāng)分化成紅細(xì)胞時相應(yīng)地增加了正常的血紅蛋白表達(dá)。將經(jīng)過編輯的人HSPC移植到NSG小鼠體內(nèi)，HSPC中的基因編輯效果可以維持整整16周，具有非常好的臨床應(yīng)用前景?；蛘闲逝c治療效果直接相關(guān)，如何進(jìn)一步提高修復(fù)后細(xì)胞的比率一直是困擾研究者的問題。利用AAV6病毒作為供體，Porteus實(shí)驗室通過電轉(zhuǎn)Cas9與sgRNA的RNP復(fù)合物來切割基因組，成功將帶有正常HBBcDNA以及tNGFR篩選標(biāo)簽的供體片段插入了SCD患者造血干細(xì)胞的HBB啟動子之后，效率達(dá)到了11%。盡管核酸酶產(chǎn)生的DSB已經(jīng)將重組效率提高了3個數(shù)量級，然而在Porteus的實(shí)驗中仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到直接用于治療的級別。為了富集基因定點(diǎn)整合的造血干細(xì)胞，Porteus研究組在插入目的基因的同時插入了tNGFR胞外段標(biāo)簽，使得它們可以通過微磁珠來富集發(fā)生正確重組的細(xì)胞，經(jīng)過富集后HBB的整合效率在tNGFRhigh細(xì)胞中約為86%。

為了提高重組效率，研究人員也在不斷尋找促進(jìn)HDR的小分子藥物如SCR7、RS-1等，抑或嘗試新的供體設(shè)計如單鏈寡核苷酸（SSODN）、HMEJ供體、硫代磷酸酯修飾供體等，不過還需要更多的實(shí)驗數(shù)據(jù)來驗證這些藥物在臨床運(yùn)用上的價值。

2.3 利用單堿基編輯工具的治療思路

雖然 HDR的靈活性和準(zhǔn)確性高，但是修復(fù)效率一直是其限制因素，使其在基因治療中的應(yīng)用充滿了局限性。迄今為止在已知的疾病數(shù)據(jù)庫中，突變類型最多的還是單堿基突變[或稱單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）]。2016年，來自哈佛大學(xué)的Liu研究團(tuán)隊、中國科學(xué)院的常興課題組以及日本神戶大學(xué)的 Akihiko Kondo團(tuán)隊先后分別利用胞苷脫氨酶 rAPOBEC1、hAID和 PmCDA1（來自七鰓鰻的AID）開發(fā)出了能夠?qū)/G堿基對突變?yōu)門/A堿基對的胞苷堿基編輯工具（cytidinebase editors，CBE）。一年后，Liu課題組又利用“噬菌體協(xié)助的持續(xù)進(jìn)化（phage-assisted continuous evolution，PACE）”創(chuàng)造出了將A/T堿基對突變?yōu)?G/C堿基對的腺苷堿基編輯工具（adenine base editors，ABE）?？傮w來說，兩類堿基編輯工具的工作原理是將不同的DNA脫氨酶（rAPOBEC1、AID 或 tadA）融合在 Cas9的 N-端表達(dá)，利用Cas9/sgRNA將脫氨酶靶向目標(biāo)序列，進(jìn)而利用各自融合的脫氨酶實(shí)現(xiàn)堿基的脫氨和轉(zhuǎn)變。

堿基編輯工具的優(yōu)勢在于編輯過程中不易發(fā)生大片段缺失、平均效率較HDR高，為疾病的精確治療提供了新的思路。其最直接的應(yīng)用是原位修復(fù)導(dǎo)致疾病的突變。2017年，Liang等首次在人類的胚胎中實(shí)現(xiàn)了β珠蛋白基因（HBB）第28位A＞G的突變修復(fù)（HBB28 A＞G是導(dǎo)致地中海貧血的常見突變之一），在概念上實(shí)現(xiàn)了利用堿基編輯工具治療遺傳疾病的目的。除此之外利用堿基編輯工具可以更精確高效地通過對剪切供體和受體的突變調(diào)控mRNA的剪切。這一點(diǎn)有望用于一些特殊的遺傳疾病，例如DMD。2018年，常興課題組利用的AID-saCas9通過外顯子跳躍技術(shù)恢復(fù)了DMD病人iPS細(xì)胞中DMD的轉(zhuǎn)錄本，從而恢復(fù)了DMD蛋白的功能。

然而，堿基編輯工具的發(fā)展目前還處于起步階段，仍然面臨著一些挑戰(zhàn)。例如，spyCas9蛋白過大導(dǎo)致單堿基編輯工具的大小普遍在4.5 Kb以上，增加了 AAV病毒的包裝難度，甚至使其無法包裝；該工作位點(diǎn)受到NGG PAM的限制；編輯窗口較寬，容易造成“旁觀者突變（Bystander mutation）”。為此研究人員包括本課題組開發(fā)出了基于Cpf1、saCas9等較小CRISPR系統(tǒng)的單堿基編輯工具，同時也在嘗試改變spyCas9的PAM識別序列。而為了解決旁觀者效應(yīng)，哈佛大學(xué)的Gehrke等通過在A3A-BE3上引入新的突變，創(chuàng)造了新的eA3A-BE3單堿基編輯工具。eA3A-BE3更傾向于突變 TCR（R為嘌呤）序列中的胞嘧啶，且保留了較高的編輯效率。他們通過將eA3A-BE3的重組蛋白與化學(xué)合成的sgRNA復(fù)合物電轉(zhuǎn)到β地貧患者造血干細(xì)胞中，精確地修復(fù)了HBB基因啟動子上的單堿基突變而幾乎不引起其他位點(diǎn)的胞嘧啶的轉(zhuǎn)換。這個新的單堿基編輯工具解決了在基因治療中單堿基編輯酶突變窗口過大可能引起周圍其他位點(diǎn)同時突變的副作用，另外利用RNP的形式遞送單堿基編輯工具也有效地解決了遞送問題。

3 體外編輯細(xì)胞的適應(yīng)性

除了針對造血干細(xì)胞進(jìn)行基因編輯用于治療血液和免疫缺陷類疾病，近來越來越多的報道將基因編輯系統(tǒng)作用于其他類型的干細(xì)胞。例如，GeraldSchwank等利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)對體外培養(yǎng)的腸干細(xì)胞進(jìn)行同源重組，對CFTR基因座進(jìn)行了校正。校正后的等位基因在克隆擴(kuò)增的類器官中表達(dá)出有功能蛋白，為單基因遺傳缺陷患者原代成人干細(xì)胞同源重組基因校正提供了理論依據(jù)。2013年，Wu等將CRISPR/Cas9系統(tǒng)成功地應(yīng)用于精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cell，SSC），通過選擇出攜帶所需基因型且沒有脫靶突變的 SSC系，讓攜帶純合遺傳缺陷的父親可以100%產(chǎn)生健康后代，為父系遺傳疾病的治療提供了新的策略。然而，對于生殖細(xì)胞的編輯將會面臨嚴(yán)肅的倫理道德問題，在這方面的倫理體系和長期安全觀察結(jié)論完善以前，此類基因編輯僅僅只能停留在實(shí)驗室研究階段。

經(jīng)過編輯的細(xì)胞移植到體內(nèi)后的命運(yùn)與基因治療的療效息息相關(guān)，若已編輯的細(xì)胞相對于未編輯的細(xì)胞具有更強(qiáng)的適應(yīng)性，必將促使編輯后的細(xì)胞具有生長優(yōu)勢，如此即使編輯的細(xì)胞數(shù)量很少，移植到體內(nèi)也可以起到治療的作用。近期有報道指出，移植后的造血干/祖細(xì)胞一部分克隆可以獨(dú)立于連續(xù)供應(yīng)的上游多能祖細(xì)胞而存活，維持譜系偏向的輸出，也就是說，有可能只要對這一小部分的細(xì)胞進(jìn)行編輯，便可以達(dá)到治療效果。

4 基因編輯療法的安全性

在基因治療的發(fā)展歷程中也曾發(fā)生過一些嚴(yán)重的安全問題，致使基因治療的發(fā)展在很長的一段時間內(nèi)停滯不前。2008年，JCI雜志報道了 4例因基因治療而導(dǎo)致白血病產(chǎn)生的案例。這 4名患者都參與了一項利用逆轉(zhuǎn)錄病毒治療重整聯(lián)合免疫缺陷（SCID-X1）的臨床試驗。雖然感染了逆轉(zhuǎn)錄病毒的CD34+細(xì)胞的確將健康的IL2RG基因帶入了患者體內(nèi)且達(dá)到了治療SCID-X1的效果。但是由于病毒載體自身帶有增強(qiáng)子元件，病毒隨機(jī)整合到了LMO2（3例）和CCND2（1例）這兩個基因附近，使這兩個基因異常表達(dá)，從而導(dǎo)致白血病的產(chǎn)生。因此，如今在進(jìn)行類似干細(xì)胞基因治療時都有必要檢測病毒載體是否在原癌基因處有隨機(jī)的插入。

干細(xì)胞或 iPS細(xì)胞經(jīng)過體外培養(yǎng)后可能累積潛在的致癌突變被認(rèn)為是干細(xì)胞治療的主要障礙之一。人類 iPS細(xì)胞的染色體不穩(wěn)定性在2010年首次被報道，常見的是12號染色體三體，它可能有助于多能干細(xì)胞增殖和重編程的選擇性優(yōu)勢，同時也是睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的標(biāo)志。2014年，1名患有滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性（exudative agerelated maculardegeneration，AMD）的日本女性移植了由自體皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng) iPS誘導(dǎo)后分化成的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，這是基于iPS細(xì)胞的細(xì)胞療法首次在人體進(jìn)行臨床試驗。然而1年后，RIKEN叫停了這項試驗，因為他們在給第 2位患者移植之前在iPS細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了突變，突變包括3種單核苷酸變異（SNV）和3種拷貝數(shù)變異（CNV），其中1個SNV列在癌癥體細(xì)胞突變的數(shù)據(jù)庫中，與單一癌癥有關(guān)。盡管當(dāng)時經(jīng)移植治療的第 1位患者并沒有表現(xiàn)出嚴(yán)重的副作用，但相關(guān)研究者仍表示需要小心跟蹤患者足夠長時間觀察任何不良細(xì)胞的生長情況。除此之外，干細(xì)胞的致癌性也有可能是由微環(huán)境和干細(xì)胞的突變共同引起，2014年，1名患有急性髓性白血病的日本男性接受了HLA匹配成功的外周血干細(xì)胞移植，但在27個月之后，白血病復(fù)發(fā)，經(jīng)診斷復(fù)發(fā)是由供體來源的IDH2和DNMT3A突變造成的。雖然這兩種突變在供體中尚未造成白血病，但由于移植后骨髓擴(kuò)增迅速以及患者同時接受免疫抑制治療，這兩點(diǎn)造成了免疫監(jiān)控系統(tǒng)缺陷，導(dǎo)致了供體白血病細(xì)胞在移植后的受體中迅速發(fā)展。

對于基因編輯策略而言，最大的擔(dān)憂是具有潛在的脫靶安全隱患。在干細(xì)胞中發(fā)生的低頻脫靶可能并不會立刻導(dǎo)致相應(yīng)的表型產(chǎn)生，但是從長遠(yuǎn)的角度看卻埋下了隱患。盡管利用預(yù)測軟件能夠分析出與靶點(diǎn)相似的潛在脫靶位點(diǎn)，還是有研究表明，在一些非典型PAM位點(diǎn)或者與靶點(diǎn)相似度較低位點(diǎn)仍然有可能有脫靶現(xiàn)象發(fā)生。全基因組測序分析對于概率極低的脫靶現(xiàn)象也很有可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。近幾年，隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展也催生出了許多靈敏度極高 的體內(nèi)、體外實(shí)驗方法以幫助檢測潛在的低頻脫靶位點(diǎn)，例如DIG seq、Circle-seq、Guide-seq等。這些方法在臨床治療時的合理運(yùn)用將會對臨床實(shí)驗的安全性起到重要的作用。

5 展望

回想半個世紀(jì)以前，人類剛剛開啟破譯遺傳密碼的旅程，對于多種遺傳病的病因還毫無頭緒。而如今我們已經(jīng)能夠編寫遺傳密碼、修復(fù)一些致病DNA突變。ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9這些工具的迭代出現(xiàn)幫助基因編輯領(lǐng)域取得了長足的進(jìn)步。隨著這些進(jìn)步我們關(guān)注的焦點(diǎn)也已經(jīng)從發(fā)現(xiàn)病因逐漸轉(zhuǎn)向了運(yùn)用新的技術(shù)和工具治愈這些遺傳疾病。在這之中，效率和安全問題一直是我們關(guān)注的兩大焦點(diǎn)。在效率問題上，一方面可以通過改進(jìn)或選取合適的遞送方式提高基因編輯工具進(jìn)入細(xì)胞的絕對量。例如針對不同的靶器官選取不同的AAV類型；利用電轉(zhuǎn)RNP的方式提高細(xì)胞體外編輯的效率同時降低脫靶；選取合適的納米材料遞送mRNA形式的基因編輯工具等。另一方面科研人員也在對人工核酸酶系統(tǒng)進(jìn)行不段的優(yōu)化，大范圍核酸酶與TALEN技術(shù)的聯(lián)合運(yùn)用；CRISPR系統(tǒng) PAM 序列的拓展以及新型CRISPR工具的不斷開發(fā)；sgRNA與供體 DNA的不同修飾，這些都有助于提高核酸酶產(chǎn)生DSB的效率或者拓展新的位點(diǎn)。在安全性上，人們也在不斷開發(fā)新的“保真型”CRISPR工具從源頭降低脫靶概率，而不斷出現(xiàn)的新型脫靶檢測技術(shù)也有助于研究員檢測和篩選編輯后的細(xì)胞。同時我們也必須看到CRISPR系統(tǒng)帶給我們的并不僅僅是一把DNA剪刀，通過不同的融合蛋白，它還能夠進(jìn)行單堿基編輯、基因表達(dá)的調(diào)控和表觀遺傳修飾。結(jié)合不同的遺傳疾病拓展這些新工具向臨床領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化，關(guān)乎到是否有更多的遺傳疾病能夠從基因治療領(lǐng)域獲益。當(dāng)然針對不同的新工具還必須開發(fā)相應(yīng)的安全評價體系。雖然在短期內(nèi)我們還不能做到高效、安全地靶向人體內(nèi)的各個器官，但是干細(xì)胞離體分離技術(shù)和類器官離體培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)逐漸發(fā)展起來。如今除造血系統(tǒng)之外，肝臟干細(xì)胞、小腸干細(xì)胞和它們各自的類器官培養(yǎng)技術(shù)都日趨完善，如何將基因編輯技術(shù)和這些技術(shù)聯(lián)合起來將會是基因編輯向臨床基因治療轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一。對于細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療而言，除了血液系統(tǒng)可以進(jìn)行有效的移植和重建外，如何將編輯改造后的細(xì)胞有效地整合到實(shí)體器官也是今后要重點(diǎn)研究和探討的科學(xué)問題。

基因編輯的興起，改變了以往對基因和細(xì)胞療法的定義，為解決許多疾病提供了新的思路和契機(jī)，但基因編輯介導(dǎo)的細(xì)胞治療仍面臨著安全性的挑戰(zhàn)，隨著新工具的開發(fā)和利用，這些技術(shù)上的問題都將會得到解決。技術(shù)的進(jìn)步往往推動倫理的發(fā)展，這就要求科學(xué)家恪守倫理道德，合理利用基因編輯工具造福人類?！?/p>

（摘自《中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報》2019年第4期）