硒多糖的合成方法及其特性研究進(jìn)展

齊鵬翔，黃雙霞，陳華磊，王帥靜，藍(lán)尉冰，陳玉穎，陳 山，3，*

(1.糖業(yè)及綜合利用教育部工程研究中心，廣西南寧530004;2.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530004;3.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西南寧530004)

硒是維持人體和動物正常生理功能所必需的微量元素，在提高機(jī)體免疫力、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗氧化、抗腫瘤等方面都發(fā)揮著重要的作用［1］。無機(jī)硒主要存在土壤、水、大氣等自然環(huán)境中，一般指單體硒以及亞硒酸、亞硒酸鹽等無機(jī)化合物。因其在體內(nèi)停留時間相對較短，多余的硒會隨著尿液很快排泄出體外，生物相容性較低，毒副作用較強(qiáng)［2－3］。有機(jī)硒主要存在于動植物體內(nèi)，主要包括硒多糖、硒氨基酸、硒蛋白質(zhì)等有機(jī)化合物［4］。人體缺硒會引起高血壓、免疫缺陷、甲狀腺腫大等多種疾?。?］。硒多糖作為一種理想的補(bǔ)硒劑，可以根據(jù)人體的缺硒情況來進(jìn)行動態(tài)的儲存和緩釋，以滿足機(jī)體補(bǔ)硒的目的［6］。

硒多糖的單糖組成一般分為單一聚糖和雜聚糖兩類，雜聚糖中的單糖通常為D－構(gòu)型。硒多糖的主鏈主要以1→3糖苷鍵連接，大多數(shù)為β－構(gòu)型，也有發(fā)現(xiàn)少數(shù)的α－構(gòu)型。硒多糖既保持了多糖較高的生物利用率和參與機(jī)體生理代謝的特點(diǎn)，又具有硒的生物功能，且毒性和副作用大大降低，生物活性普遍高于硒和多糖［7］。天然硒多糖主要來源于植物和具有富硒能力的微生物，由于植物和微生物的硒富集作用是有限的，從而導(dǎo)致天然硒多糖含量較少。因此，硒多糖的合成優(yōu)化與開發(fā)仍是尋找先導(dǎo)有機(jī)硒和候選藥物的熱點(diǎn)研究方向。本文就硒多糖的結(jié)構(gòu)及合成方法進(jìn)行闡述，并對其安全特性的研究進(jìn)行分析和討論。

1 硒多糖的合成方法

目前，人工合成硒多糖的方法主要包括化學(xué)合成法、植物轉(zhuǎn)化法和微生物轉(zhuǎn)化法。

1.1 化學(xué)合成法

硒多糖的化學(xué)合成法主要是利用多糖鏈上的羥基、氨基等活性基團(tuán)與硒化試劑中的含硒化合物結(jié)合，從而將無機(jī)硒通過共價鍵接合在糖鏈上，形成硒多糖。

1.1.1 以單體硒或含有亞硒酸根離子(SeO23－)的化合物為硒化體系合成硒多糖 在H2SeO3/HNO3和BaCl2的硒化體系中，HNO3和BaCl2作為催化劑可以加快硒化反應(yīng)的進(jìn)行。HNO3可以為反應(yīng)體系創(chuàng)造酸性環(huán)境，使多糖鏈上活性基團(tuán)和硒化試劑發(fā)生反應(yīng)。由于BaCl2中的Ba2+與羥基的強(qiáng)配位作用［8］，有利于促進(jìn)配合物的形成。較強(qiáng)的配位性可以增強(qiáng)羥基的親核性并形成穩(wěn)定單一的配合物，如圖1所示。

圖1 酸性條件下BaCl2催化硒多糖合成的反應(yīng)機(jī)理［9］Fig.1 Synthesis mechanism of selenium polysaccharide catalyzed by BaCl2 under acidic conditions［9］

Wang等［9］先從沙蒿中萃取出沙蒿多糖(ASP)，使用H2SeO3為硒化試劑，以HNO3和BaCl2作為催化劑催化合成了沙蒿硒多糖(SeASP)。隨著BaCl2的加入，硒多糖的含硒量有顯著的增加，說明Ba2+可以提高硒化反應(yīng)體系的硒化效率。Wei等［10］針對阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)合成了具有預(yù)防和治療效果的海參硒多糖衍生物(Se－RHP)。Zhang等［11］使用 HNO3為催化劑，Na2SeO3為硒化試劑，以硒含量為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化紅棗硒多糖的合成工藝。該法硒化成本較低，但反應(yīng)步驟較多，產(chǎn)率低，較難實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

通過優(yōu)化硒化反應(yīng)體系的物理?xiàng)l件，可以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行，提高合成效率，減少化學(xué)試劑的使用量。胡向東等［12］向溶解有多糖的稀HNO3溶液中，充入惰性氣體，將硒化試劑(Na2SeO3)以噴霧形式添加入反應(yīng)體系。該方法增加了反應(yīng)體系的接觸表面積，同時避免了硒化試劑的氧化，提高了反應(yīng)的效率。微波、超聲波輔助合成因其方法簡單，具有較高的效率，逐漸成為研究熱點(diǎn)。Zhu等［13］采用超聲波輔助合成了蛹蟲草硒多糖(SeCPS)。Zhao等［14］將蕨麻多糖(PAP)與稀HNO3混合，加入Na2SeO3后，在一定的溫度下進(jìn)行微波輔助硒化反應(yīng)的進(jìn)行，得到的蕨麻硒多糖(SePAP)仍然具有良好的生物活性。采用物理輔助合成硒多糖的產(chǎn)率高，減少化學(xué)重金屬催化劑的使用，操作步驟簡單，反應(yīng)易控制，生產(chǎn)工藝綠色環(huán)保，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

1.1.2 以二氯氧化硒(SeOCl2)為硒化體系合成硒多糖 光氣(COCl2)可以與糖鏈上相鄰的兩個羥基(－OH)反應(yīng)，生成順式的五元環(huán)形結(jié)構(gòu)的碳酸酯(1，2)。而與COCl2的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相似且同樣具有酰氯結(jié)構(gòu)的二氯氧化硒(SeOCl2)可以與醇作用生成亞硒酸酯型的化合物。龔曉鐘［15］將黃芪多糖Ⅱ(D－葡聚糖)加入到無水吡啶中，攪拌均勻后加入硒化試劑(SeOCl2)，得到淺粉色的黃芪硒多糖Ⅱ。姜禮輝等［16］在此基礎(chǔ)上改進(jìn)了酰氯硒化法。該法先將黃芪多糖加入到無水吡啶介質(zhì)中，充分分散均勻后依次滴加 SeOCl2、C4H6O4(丁二酸)、NaNO3溶液，得到硒化黃芪多糖。NaNO3作為穩(wěn)定劑，提高了產(chǎn)物的穩(wěn)定性。加入C4H6O4(丁二酸)可以加快反應(yīng)的進(jìn)行，減少硒化試劑的用量和硒化反應(yīng)時間，提高了硒化效率和生物學(xué)效價。但SeOCl2不易制備且性質(zhì)不穩(wěn)定，在空氣中容易發(fā)生水解，此反應(yīng)還會產(chǎn)生H2Se等有毒氣體，制備過程繁瑣，產(chǎn)率較低。對于SeOCl2硒化法的改進(jìn)和優(yōu)化，仍是今后的研究方向。

1.1.3 以含硒有機(jī)基團(tuán)為硒化體系合成硒多糖 支鏈中存在著氨基、羥基等活性基團(tuán)的多糖，可以通過添加不同種類的有機(jī)含硒化合物對支鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，從而得到硒多糖。張帆［17］利用含有氨基和羥基的天然高分子殼聚糖，分別加入鄰甲硒基苯甲酸－(對－硝基)苯酚酯、2－(4－苯甲酸甲酯)－1，2－苯并異硒唑－3(2H)－酮、硒代二乙酸，采用化學(xué)合成的方法對殼聚糖進(jìn)行硒化，分別得到了三種硒殼聚糖衍生物。合成的硒化殼聚糖脫乙酰度明顯降低，可能是由于殼聚糖中的氨基和羥基與硒化試劑發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，引入了親水基團(tuán)，其水溶性和抗氧化活性都有很大的改善，有利于提高硒化殼聚糖產(chǎn)品的穩(wěn)定性和生物利用率［18－19］。

1.2 植物轉(zhuǎn)化法

通過植物的生物富集作用來轉(zhuǎn)化有機(jī)硒，是目前最有效、最安全的選擇之一。人體硒來源主要通過動植物硒的攝入，而動物的硒來源主要通過植物來獲取，故植物硒相比動物硒具有更高的生物效價［20］。硒多糖的植物轉(zhuǎn)化法就是利用植物的根和葉對無機(jī)硒(主要是Se4+和Se6+)的吸收，通過自身的生長代謝和生物轉(zhuǎn)化作用，將添加到土壤或培養(yǎng)基中的亞硒酸鹽、硒酸鹽等與多糖結(jié)合轉(zhuǎn)化成為硒多糖。土壤酸堿類型的不同硒的存在形式在亞硒酸鈉和亞硒酸之間轉(zhuǎn)化，影響著植物中硒的積累速度［21］。不同植物的含糖量不同，對硒的富集作用差別也比較大［22］。所以一般含硒多糖較多的植物，其本身也有一定的含糖量。一般選用黨參、黃芪、小麥、油菜等富硒較多的植物來進(jìn)行植物轉(zhuǎn)化硒多糖的原料。

通過植物進(jìn)行富硒培養(yǎng)，一般以盆栽實(shí)驗(yàn)和葉面噴灑法為主。Zhu等［23］采用盆栽實(shí)驗(yàn)，向土壤中分別施用不同濃度的Na2SeO3，對黨參進(jìn)行富硒培養(yǎng)。與對照組相比，富硒培養(yǎng)黨參的根、莖、葉片、果實(shí)中均能檢測到更多的總黃酮、多糖、總皂苷含量。黨參從根部吸收無機(jī)硒后，硒原子主要與可溶性蛋白相結(jié)合，同時也有部分無機(jī)硒與多糖結(jié)合生成黨參硒多糖［24］。Galinha 等［25］同樣采用盆栽實(shí)驗(yàn)研究了通過土壤添加硒肥小麥富硒的能力。結(jié)果表明，在施用最佳濃度硒肥時，與未施硒肥作物相比，Jordo、Roxo、Marialva 和 Celta 四種小麥中的硒含量可分別提高2、16、18 和20 倍。Fahim 等［26］采用葉面噴灑法，研究了在葉面噴灑硒溶液可降低細(xì)胞的滲透壓，提高了葉片的蒸騰速率，還可能參與植物體內(nèi)糖類的合成過程，從而增加植物體內(nèi)硒多糖的積累。由于土壤吸附、化學(xué)和微生物的作用，可能會引起硒的損失或者轉(zhuǎn)化［27］。所以，與盆栽法相比，葉面噴灑硒的方法有簡單、高效、成本較低等特點(diǎn)。目前，洋蔥［27］、胡蘿卜［28］、大蒜［29］、稻米［30］、小麥［31］等通過葉面噴灑硒溶液已經(jīng)獲得良好的富硒效果。

無論采用盆栽實(shí)驗(yàn)還是葉面噴灑法，都是通過外源性添加無機(jī)硒，利用植物的吸收代謝作用，將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒。再以收集富硒后的植物為原材料，經(jīng)過洗滌、干燥、粉碎等前處理后，采用熱水浸提［32］、稀堿液浸提［33］、微波－超聲波輔助提?。?4］等方法來提取出植物硒多糖。所以，植物轉(zhuǎn)化法中提取硒多糖的前處理較為復(fù)雜，又由于植物的生長周期較長，在一定程度上限制了植物轉(zhuǎn)化法的高效生產(chǎn)。

1.3 微生物轉(zhuǎn)化法

硒元素與硫元素在化學(xué)周期表中同主族，兩者有著相似的化學(xué)性質(zhì)，硒在微生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制與硫較為相似。被微生物吸收的硒經(jīng)過生物體內(nèi)氧化、還原等過程，可在細(xì)胞中形成具有可溶性(和)和不溶性(Se0)形式的硒作為末端電子受體來參與硒化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)［35］。微生物對硒的積累一種是在細(xì)胞外，硒與細(xì)胞壁中多糖類物質(zhì)的生物吸附組裝結(jié)合形成配體;另一種是在細(xì)胞內(nèi)，硒離子通過細(xì)胞膜的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)行生物富硒作用［36］。

1.3.1 無機(jī)硒微生物轉(zhuǎn)化法 無機(jī)硒微生物轉(zhuǎn)化硒多糖就是在溫和的培養(yǎng)條件下，將真菌、細(xì)菌等微生物的培養(yǎng)基中添加適宜濃度的外源性無機(jī)硒，將環(huán)境中添加的無機(jī)硒結(jié)合到細(xì)胞多糖的結(jié)構(gòu)上。近年來，關(guān)于在營養(yǎng)培養(yǎng)基中加入無機(jī)硒如亞硒酸鈉(Na2SeO3)，在一定的條件下，培養(yǎng)酵母、靈芝、蘑菇等真菌的報(bào)道越來越多［37－39］。酵母培養(yǎng)簡單、易生長，是世界公認(rèn)的安全可食用性微生物之一，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、制藥工程、基因工程等領(lǐng)域。酵母細(xì)胞具有很強(qiáng)的富硒能力和生長能力，可以通過自身的代謝，將吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的無機(jī)硒與細(xì)胞生物質(zhì)結(jié)合，從而生成有機(jī)硒［37］。蘑菇能夠從土壤或營養(yǎng)培養(yǎng)基中積累許多微量元素，包括硒，使得這些微生物成為日常飲食中硒的重要來源［38］。根據(jù)研究表明，酵母菌和真菌細(xì)胞壁成分(如多糖和蛋白質(zhì))可通過生物吸附作用與無機(jī)硒化合物結(jié)合［39］。采用細(xì)菌合成硒多糖也是一種穩(wěn)定高效的合成方法。Zhou等［40］選擇陰溝腸桿菌Z0206，在富硒(Na2SeO3)培養(yǎng)基中得到活性穩(wěn)定的硒多糖(Se－ECZ－EPS－1)，實(shí)現(xiàn)了將無機(jī)硒向硒多糖的有效轉(zhuǎn)化。由于無機(jī)硒化合物對菌體具有一定的毒副作用，高濃度的無機(jī)硒會影響菌體的正常生長，從而在一定程度上限制了生物體內(nèi)有機(jī)硒的高生物量積累。

1.3.2 有機(jī)硒微生物轉(zhuǎn)化法 為了避免無機(jī)硒對菌體的毒副作用，Malinowska等［41］首次將有機(jī)形式的硒(Selol)加入營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)猴頭菇(Hericiumerinaceus)，與無機(jī)硒(Na2SeO3)加入營養(yǎng)培養(yǎng)基的對照組相比，添加有機(jī)硒的猴頭菇合成了更多的硒多糖，并且具有更好的抗氧化能力。通過添加Selol來進(jìn)行微生物富硒培養(yǎng)，減少了無機(jī)硒對菌體細(xì)胞毒副作用的影響，對未來膳食補(bǔ)充劑中的新型硒源探索有著良好的指導(dǎo)作用。

微生物轉(zhuǎn)化法中生物機(jī)體的生長周期較植物轉(zhuǎn)化法短，產(chǎn)物活性較為穩(wěn)定，不易分解。但培養(yǎng)菌體所需成本較高，硒化體系較為復(fù)雜，從而導(dǎo)致產(chǎn)物分離較為困難。

2 硒多糖的生理特性

2.1 硒多糖的免疫活性

近年來，對硒多糖的免疫活性研究已成為國內(nèi)外研究的熱門課題。Chen等［42］發(fā)現(xiàn)銀杏硒多糖(Se－GBLP)可增強(qiáng)促凋亡Bax蛋白的表達(dá)，使線粒體膜電位喪失，從而導(dǎo)致人體膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡，可作為預(yù)防或治療膀胱癌的潛在藥物。淋巴細(xì)胞的增殖情況反映了細(xì)胞免疫狀態(tài)［43］，并且是評估細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)［44］。路則慶［42］研究了由細(xì)菌(Enterobacter cloacae Z0206)生物轉(zhuǎn)化后的硒多糖(Se－ECZ－EPS)對斷奶仔豬的免疫改善作用。結(jié)果顯示，在日糧中添加 Se－ECZ－EPS比添加 Na2SeO3的仔豬體重有明顯的提高，硒多糖組明顯提高了仔豬的血清中免疫球蛋白、細(xì)胞因子的含量，促進(jìn)了抗菌肽基因PR－39的表達(dá)，說明硒經(jīng)過生物多糖修飾后，可顯著增強(qiáng)仔豬的免疫能力。Qin等［45］從天然當(dāng)歸中提取當(dāng)歸多糖(CAP)進(jìn)行不同程度的硒化修飾，以未經(jīng)硒化的當(dāng)歸多糖進(jìn)行對照，對比兩組雞淋巴細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果表明，硒化修飾后的當(dāng)歸多糖可以顯著提高淋巴細(xì)胞的增值能力，從而具有更好的細(xì)胞免疫活性。

2.2 硒多糖的毒性

多糖類物質(zhì)對藥物進(jìn)行修飾能夠降低先導(dǎo)化合物的毒性并提高其藥用活性，在糖修飾之前一般具有很強(qiáng)的毒副作用，經(jīng)過多糖修飾后，毒性明顯降低，并且活性得到了提高［13，19，42，46］。雖然硒多糖要比無機(jī)硒的毒性低，但其仍具有潛在的毒性［47］。Lin等［48］使用桔梗硒多糖對小鼠進(jìn)行急毒研究:分別注射相同濃度梯度的Na2SeO3和硒多糖，觀察小鼠身體機(jī)能變化。數(shù)天后，硒多糖高劑量組出現(xiàn)情緒低迷、腹瀉等中毒癥狀;而亞硒酸鈉高劑量組出現(xiàn)呼吸困難、抽搐，甚至死亡等更加嚴(yán)重的中毒現(xiàn)象。觀察小鼠的健康狀態(tài)，初步推斷出亞硒酸鈉相比硒多糖在相同濃度的情況下具有更強(qiáng)的毒性。與無機(jī)硒相比，有關(guān)硒多糖的安全性報(bào)道相對較少，還有待進(jìn)一步建立成熟的硒多糖評價體系。目前，已成功合成的甘草硒多糖、硒化黃芪多糖、硒化殼聚糖等，被廣泛應(yīng)用于癌癥、氧化損傷、高血脂等疾病的輔助治療［15，18］。為了評估硒多糖臨床應(yīng)用的可靠性，需要先對不同濃度的硒多糖進(jìn)行安全性評價。經(jīng)過毒性實(shí)驗(yàn)篩選出硒多糖的安全濃度范圍，這對之后實(shí)際應(yīng)用和生產(chǎn)都具有重要的指導(dǎo)作用。

3 結(jié)語

隨著硒多糖的生理活性越來越受到人們的重視，其合成方法逐漸成為了研究熱點(diǎn)。目前，硒多糖的合成主要通過化學(xué)轉(zhuǎn)化和生物代謝兩種方式對多糖進(jìn)行硒化改性。雖然各方法都有其限制條件，但通過生物代謝合成硒多糖可減少化學(xué)試劑的使用，避免了重金屬催化劑的添加，得到的硒化產(chǎn)物毒副作用較低，較符合臨床的使用條件。所以，人工合成硒多糖應(yīng)用較為廣泛的是植物和微生物轉(zhuǎn)化法。但硒多糖的合成方法還有待進(jìn)一步的深入研究，新型合成方法應(yīng)具有更加簡單的合成體系、高效的硒化效率、產(chǎn)物活性更加穩(wěn)定等特點(diǎn)。

雖然多糖經(jīng)過經(jīng)硒化修飾后可以增強(qiáng)其免疫活性，但由于目前硒多糖合成方法的研究并不十分完善，其生成產(chǎn)物的潛在毒性依然要引起重視。所以，如何構(gòu)建科學(xué)的硒多糖毒性評價體系是將來的研究重點(diǎn)。這對提高富硒藥物的療效，生產(chǎn)、研發(fā)更加安全健康的食品以及保健品領(lǐng)域都具有十分重要的意義。