數(shù)字PCR技術(shù)及其在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

尚雷鵬，劉金杰，張慶霞

（1.北京市海淀區(qū)公安司法鑒定中心，北京 100192；2.北京市公安司法鑒定中心，北京 100192）

1 dPCR技術(shù)簡介

1992年，SYKES等[1]使用有限稀釋、PCR和泊松分布模型的方法，檢測到了復(fù)雜背景下低豐度IgH重鏈突變基因，并對其進(jìn)行了精細(xì)的定量研究。該研究提出了數(shù)字PCR的構(gòu)想，與此同時(shí)闡明了dPCR檢測的原則:以“終點(diǎn)信號的有或無”作為定量方法，這是該方法被命名為dPCR技術(shù)的主要原因[2]。1997年，KALININA等[3]使用玻璃毛細(xì)管進(jìn)行了微升級的PCR反應(yīng)，通過使用熒光探針收集到了基因組DNA的單分子信號，進(jìn)而促進(jìn)了單分子定量技術(shù)的發(fā)展。1999年，VOGELSTEIN等[4]在分析結(jié)腸癌患者糞便，并檢測KRAS基因突變時(shí)，率先把樣本分配到384孔板中，然后對突變基因和正?；蚴褂貌煌瑹晒膺M(jìn)行檢測，通過計(jì)算突變基因和正常基因的比例來得出突變率?；谠搶?shí)驗(yàn)方法的成功，他們正式提出了dPCR概念。目前，dPCR技術(shù)已經(jīng)迅速發(fā)展成為一種核酸定量分析技術(shù)和核酸定量檢測技術(shù)。dPCR技術(shù)已經(jīng)投入商業(yè)化生產(chǎn)，可以分成兩大類:微滴式 dPCR（droplet dPCR，ddPCR）和芯片式 dPCR （chip dPCR，cdPCR）技術(shù)。

2 dPCR技術(shù)原理

dPCR采用直接計(jì)數(shù)目標(biāo)分子數(shù)而不依靠任何校準(zhǔn)物或外標(biāo)，通過計(jì)數(shù)單個(gè)分子從而實(shí)現(xiàn)絕對定量。dPCR將傳統(tǒng)PCR的指數(shù)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，僅僅通過顯示程序設(shè)定的循環(huán)數(shù)后擴(kuò)增是否發(fā)生，即可達(dá)到核酸的絕對定量。dPCR通過“油包水”的形式將反應(yīng)體系分割成一個(gè)個(gè)小微滴，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對所發(fā)生的擴(kuò)增反應(yīng)樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)[5]。dPCR在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)前，將含有DNA模板的PCR溶液稀釋后分布到大量的獨(dú)立反應(yīng)室，單分子間通過稀釋分離，并且獨(dú)自進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最后分析每個(gè)擴(kuò)增產(chǎn)物。具體而言，就是采用“分而治之”的檢測策略:將起始待測模板細(xì)分為若干小份，使每1份中至多分配到1個(gè)核酸分子，在每個(gè)小份中使得單個(gè)拷貝核酸分子進(jìn)行PCR反應(yīng)，最后計(jì)數(shù)有擴(kuò)增反應(yīng)小份的數(shù)量即可確定目標(biāo)模板拷貝數(shù)。這種核酸定量方法實(shí)現(xiàn)了對單個(gè)DNA分子的擴(kuò)增反應(yīng)和檢測，每個(gè)模板 DNA分子的反應(yīng)結(jié)果，根據(jù)有無熒光信號分別標(biāo)記陽性微滴為“1”，陰性微滴為“0”，計(jì)數(shù)結(jié)果根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的比例，進(jìn)而計(jì)算出待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)[6-7]。這實(shí)現(xiàn)了通過先于PCR擴(kuò)增的樣品分離。這種樣品的分配可以消除本底信號的影響，提高低豐度靶標(biāo)的擴(kuò)增靈敏度，簡單計(jì)算出DNA的模板拷貝數(shù)而不需要采用參考標(biāo)準(zhǔn)物或者外標(biāo)。因此，dPCR技術(shù)是一種對待測核酸分子進(jìn)行絕對定量的方法[8]。

3 dPCR技術(shù)的特點(diǎn)及其應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)的可行性

與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，dPCR具有高靈敏度、高精確度、高耐受性和絕對定量的優(yōu)點(diǎn)，成為了法醫(yī)學(xué)研究中的重要工具。

3.1 高靈敏度

在法醫(yī)學(xué)實(shí)際案件中，常見的脫落細(xì)胞等接觸類檢材最為常見，通常其模板量低而不易獲得。而dPCR技術(shù)通過“油包水”的形式將反應(yīng)體系進(jìn)行微滴分割，每個(gè)微滴獨(dú)立進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)過40～45個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，不僅能消除本底信號的影響，而且能提高低豐度靶標(biāo)的擴(kuò)增靈敏度，特別適用于痕量待測樣品。傳統(tǒng)的毛細(xì)管電泳和定量PCR的檢測靈敏度約為0.1%～1%；二代測序的靈敏度可達(dá)到10%；而最新的QX200微滴式數(shù)字PCR在高豐度野生型序列構(gòu)成的干擾背景中檢測低頻率的突變序列，靈敏度可達(dá)到0.001%～0.0001%?；诖?，dPCR技術(shù)還可以實(shí)現(xiàn)檢測大量樣品中的微量待測分子的目的，在病原微生物的檢測中有著廣泛的應(yīng)用[9-10]。

3.2 高精確度

dPCR技術(shù)在計(jì)算數(shù)萬個(gè)反應(yīng)單元中陽性反應(yīng)單元的數(shù)量和比例時(shí)，能夠精確地檢測出變化微小的目的序列差異。目前對于低豐度目標(biāo)序列的檢測，背景DNA會(huì)干擾定量 PCR、雜交、毛細(xì)管測序及NGS等方法，使其精確度檢測不夠準(zhǔn)確。而經(jīng)過微滴化處理的微滴式dPCR系統(tǒng)可將稀有核酸序列與大量的背景DNA分開，最終提高檢測的精確度及重復(fù)性。

3.3 高耐受性

在dPCR技術(shù)的第一步反應(yīng)體系分配過程中，某些反應(yīng)單元會(huì)一定程度地富集低豐度的目的序列。在該類反應(yīng)單元中低豐度的目的序列會(huì)顯著地降低背景序列和抑制物對反應(yīng)的干擾；dPCR技術(shù)對每個(gè)反應(yīng)單元的結(jié)果判讀簡單，僅需要判斷陽性／陰性狀態(tài)即可。因此，基于dPCR技術(shù)對背景序列和抑制物的高度耐受能力以及無需依賴Ct值，很少受擴(kuò)增效率影響的特點(diǎn)，使得在法庭科學(xué)案件的檢測當(dāng)中dPCR技術(shù)較之于常規(guī)PCR技術(shù)具有很大的優(yōu)勢。

3.4 絕對定量

在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，該技術(shù)的絕對定量優(yōu)勢體現(xiàn)在當(dāng)應(yīng)用dPCR直接計(jì)算目的序列的拷貝數(shù)時(shí)，無需依賴Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進(jìn)行精確的絕對定量檢測，其精確定量能力優(yōu)于常規(guī)的RT-PCR技術(shù)。

4 dPCR技術(shù)在法醫(yī)學(xué)中的實(shí)際應(yīng)用

4.1 dPCR技術(shù)在下一代測序方面的應(yīng)用

二代測序文庫的定量是確保測序平臺(tái)準(zhǔn)確、高效的重要前提，dPCR為高通量測序提供了靈敏的和絕對的校準(zhǔn)[11]。下一代測序（next generation sequencing,NGS）如 454，Solexa和 SOLiD平臺(tái)需要通過測序校正分子數(shù)量。然而，dPCR可以精確定量454和Solexa測序文庫，使其制備達(dá)到納克級，同時(shí)在儀器滴定的成本和時(shí)間方面節(jié)省了花費(fèi)。

WHITE等[12]的研究結(jié)果首次證明了使用454平臺(tái)進(jìn)行皮克級DNA樣品測序，在無預(yù)擴(kuò)增時(shí)對DNA樣品的需求量降為原來的1/1000以下。dPCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了測序文庫的絕對定量，消除了一些不確定因素如構(gòu)建和PCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線等，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%，無滴定情況下，符合直接測序的精度要求。dPCR微滴擴(kuò)增產(chǎn)物可以方便回收，為測序文庫預(yù)擴(kuò)增提供了新的手段，有利于減少擴(kuò)增偏好性的不利影響，增加稀有序列的覆蓋度，對稀有突變和拷貝數(shù)變異具有極大的優(yōu)勢。

TOSHIKATSU MITSUI等[13]首次采用 NGS對甲狀旁腺功能減退癥病人進(jìn)行了全基因組測序，測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)GCM2相關(guān)的突變。在對該突變位點(diǎn)進(jìn)行確認(rèn)的時(shí)候采用了aCGH和微滴式數(shù)字PCR兩種不同的平臺(tái)。aCGH未能確認(rèn) NGS的結(jié)論，但是ddPCR的結(jié)果完美地支持了NGS的推論。這也是首次采用ddPCR方法驗(yàn)證NGS發(fā)現(xiàn)的亞微觀水平的缺失。

4.2 dPCR技術(shù)在種屬鑒定和定量方面的應(yīng)用

目前常用的方法有毛細(xì)管電泳法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。但這兩種檢驗(yàn)方法對于樣本DNA的含量要求拷貝數(shù)高于十個(gè)拷貝且實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)只能進(jìn)行相對定量，所得結(jié)果易受多種因素影響[14]。

微滴式dPCR技術(shù)，是將樣本通過微滴發(fā)生器進(jìn)行微滴化處理，制成若干微滴后進(jìn)行的 PCR反應(yīng)。 PCR反應(yīng)結(jié)束后，由微滴檢測器對每個(gè)微滴逐個(gè)檢測，最終經(jīng)分析軟件計(jì)算出目標(biāo)DNA分子的濃度（copies/μL）[15]。微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)與傳統(tǒng)方法相比，在低濃度樣本檢測中，具有更高的靈敏度和穩(wěn)定性。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR等傳統(tǒng)方法因受到非目標(biāo)DNA或雜質(zhì)的干擾，使得檢測靈敏度及精確性都達(dá)不到精細(xì)定量的要求，而微滴式數(shù)字PCR通過微滴化處理，使得目標(biāo)片段從大量的非目標(biāo)DNA或雜質(zhì)中分離出來，在單個(gè)微滴中獨(dú)立地進(jìn)行PCR反應(yīng)，從而提高了檢測的靈敏度[16-17]。當(dāng)模板DNA濃度低到個(gè)位數(shù)拷貝每微升的時(shí)候，檢測結(jié)果會(huì)出現(xiàn)一定的偏差，這和模板DNA稀釋過程中的誤差、樣本加入時(shí)的取樣誤差相關(guān)。

4.3 dPCR技術(shù)在病原微生物的檢測的應(yīng)用

2016年5 月，美國奧巴馬政府宣布美國國家微生物組計(jì)劃啟動(dòng)，微生物組學(xué)研究成為熱點(diǎn)。dPCR技術(shù)高通量擴(kuò)增和分析的優(yōu)點(diǎn)使同時(shí)研究自然界的多個(gè)細(xì)菌單細(xì)胞的多個(gè)不同基因得以實(shí)現(xiàn)。利用dPCR靈敏度高的特點(diǎn)，可以對各種樣品中的病原微生物展開廣泛的研究，還有可能在宏基因組學(xué)的研究中對低豐度、特定種屬的微生物進(jìn)行檢測，彌補(bǔ)NGS的不足。如HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療過程中病毒殘留量的監(jiān)控；HBV耐藥突變的檢測；HCV的分子分型；抗甲氧西林金黃色葡萄球菌的院內(nèi)感染監(jiān)控；環(huán)境微生物不同功能基因之間的連鎖分析等等。dPCR技術(shù)無需核酸標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)對病原微生物的絕對定量，有利于不同環(huán)境檢測機(jī)構(gòu)間的數(shù)據(jù)比較和分析，為危害公共衛(wèi)生安全的疾病的防控提供量化標(biāo)準(zhǔn)和參考。

另外，dPCR技術(shù)對 PCR抑制物不敏感，能克服環(huán)境樣本（如污水、污泥、土壤等）中大量含有的抑制物的影響，高靈敏的檢出可能存在的病原微生物，實(shí)現(xiàn)超早期準(zhǔn)確預(yù)警。NEJC RACKI等[9]通過對梯度稀釋的輪狀病毒RNA和不同濃度污水處理廠廢水組合樣本的系統(tǒng)測試，以及不同地表水樣本的實(shí)際檢測，利用ddPCR單分子計(jì)數(shù)的定量方式，在無標(biāo)準(zhǔn)品校正情況下不僅實(shí)現(xiàn)了對微量病毒高靈敏的絕對定量檢出，同時(shí)展示出 qPCR不可比擬的重復(fù)性及精確度，以及對廢水中 PCR抑制物的耐受能力。

4.4 dPCR技術(shù)在甲基化水平分析檢測的應(yīng)用

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，是表觀遺傳學(xué)（Epigenetics）的重要組成部分。在法庭科學(xué)領(lǐng)域，DNA甲基化在組織體液鑒定、同卵雙生子鑒定、年齡推斷、性別推斷和親子鑒定等方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值，有望成為一種新的法醫(yī)學(xué)遺傳標(biāo)記。以目前法庭科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)、難點(diǎn)問題同卵雙生子鑒別為例，表觀遺傳研究顯示，同卵雙生子雖具有完全相同的基因組DNA，但同卵雙生子個(gè)體間DNA甲基化和組蛋白乙酰化差異顯著，某些CpG島區(qū)域的甲基化程度差異甚至超過了無關(guān)個(gè)體間的差異[18]。

OLLIKAINEN等[19]研究發(fā)現(xiàn)，同卵雙生子新生兒不同組織IGF/H19相關(guān)的4個(gè)差異甲基化區(qū)域的甲基化狀態(tài)有顯著差異，并認(rèn)為DNA甲基化可作為同卵雙生子個(gè)體甄別的有效生物學(xué)標(biāo)記。然而現(xiàn)有的甲基化水平分析方法存在回收率不高，會(huì)造成大量 DNA的損失；轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化不徹底或轉(zhuǎn)化過度；DNA的降解和處理中片段化等問題，降低了后續(xù)分析的準(zhǔn)確度。而微滴式dPCR系統(tǒng)憑借其優(yōu)異的靈敏度、精確度和對目標(biāo)因子的絕對拷貝數(shù)定量的特性，為甲基化程度的精確分析提供了一種新的方法。

KUNIO MIYAKE等[20]對一對患有雷特氏綜合癥的同卵雙生雙胞胎進(jìn)行了基因組學(xué)以及表觀遺傳學(xué)的研究，文章對該雙胞胎姐妹（其中一個(gè)為非典型 RTT，另一個(gè)為典型RTT）采用了第一代毛細(xì)管測序，二代測序、SNP和 CNV芯片、基因組 DNA甲基化芯片、定量 PCR以及微滴式數(shù)字 PCR（QX100）各種分析方法，得出結(jié)論:是表觀遺傳學(xué)水平上的差異，導(dǎo)致了 2姐妹不同的臨床表現(xiàn)，而非基因組水平上的差異。表觀遺傳學(xué)上的差異也許主要源自 X染色體失活。TODD BLEVINS[21]率先將ddPCR技術(shù)應(yīng)用到植物學(xué)（擬南芥）檢測領(lǐng)域，文章鑒定了脫乙?；?6（HDA6）和甲基化轉(zhuǎn)移酶MET1之間的關(guān)系。他們發(fā)現(xiàn)這兩種酶在維持甲基化中的伙伴關(guān)系，可以解釋導(dǎo)致沉默位點(diǎn)識(shí)別的表觀遺傳記憶永久性，并解釋這兩種植物特異基因沉默酶的招募基礎(chǔ)。研究人員利用 QX100微滴式數(shù)字PCR對相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，以判斷相關(guān)基因沉默發(fā)生與否。

4.5 dPCR技術(shù)的挑戰(zhàn)與展望

盡管dPCR概念的提出至今已經(jīng)有二十多年，但其應(yīng)用仍處于初級階段，其在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨很大的挑戰(zhàn)[22-25]。如dPCR技術(shù)并不成熟，微滴發(fā)生與制備技術(shù)的不完善，所使用的現(xiàn)行儀器并不能實(shí)現(xiàn)更多微滴的產(chǎn)生。另外，微滴檢測的絕對定量能力方面仍需要進(jìn)一步的提升。

綜合dPCR技術(shù)的特點(diǎn)和優(yōu)勢，dPCR具有測量獨(dú)立性與無需任何校準(zhǔn)物的特點(diǎn)。因此，該技術(shù)是潛在的核酸測量基準(zhǔn)方法，并從原理上為核酸計(jì)量提供了保證。相比其他方法，dPCR作為絕對定量方法能準(zhǔn)確定量目標(biāo)DNA和提供可靠的定量數(shù)據(jù)。dPCR技術(shù)已經(jīng)在二代測序文庫制備及驗(yàn)證、種屬鑒定、病原微生物檢測、甲基化分析檢測、稀有突變檢測及復(fù)雜樣本基因表達(dá)檢測等方面有著廣泛的應(yīng)用。dPCR技術(shù)作為一個(gè)嶄新的檢測技術(shù)平臺(tái)，開辟了一種全新的技術(shù)思路和手段，因此在未來幾年內(nèi)，dPCR有望從一種小眾的技術(shù)手段發(fā)展成為實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)工具，其應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，必然會(huì)促進(jìn)法醫(yī)學(xué)的發(fā)展。