三參生血顆粒對60Co照射所致C57BL/6小鼠造血及免疫系統(tǒng)不良反應(yīng)治療作用的研究*

劉文秀，楊 娟，曹 博，高 院，徐紅維

1.延安大學(xué)附屬醫(yī)院放射科(延安 716000)；2.陜西省延安市人民醫(yī)院肺病科(延安 716000)；3.西安鳳城醫(yī)院影像科(西安 710016)

惡性腫瘤的放射治療時(shí)，放療射線在對腫瘤病灶進(jìn)行直接殺傷作用的同時(shí)，還可對正常組織產(chǎn)生較強(qiáng)影響，造成機(jī)體出現(xiàn)一系列應(yīng)激變化,引起體內(nèi)氧自由基含量增高,最終導(dǎo)致造血及免疫系統(tǒng)出現(xiàn)損傷，嚴(yán)重影響患者的生命健康[1-2]。因此，如何對放療所致造血及免疫系統(tǒng)損傷進(jìn)行有效的治療是臨床迫切需要解決的重大課題[3]。三參生血顆粒是我院在長期的臨床觀察基礎(chǔ)上，由多位名老中醫(yī)共同擬定的抗腫瘤輔助方劑，筆者觀察了三參生血顆粒對60Co照射所致C57BL/6小鼠造血及免疫系統(tǒng)不良反應(yīng)的治療作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

材料與方法

1 動(dòng)物與分組方法 50只6周齡雄性C57BL/6雄性小鼠，均購買于陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量范圍均為18 g～22 g，平均體質(zhì)量(20.2±2.1)g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK(陜)2017-0198。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均于二級動(dòng)物室中開展，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均進(jìn)行為期7 d的適應(yīng)性喂養(yǎng)后方可使用，動(dòng)物房相對濕度保持在45%～70%，溫度保持在20℃～25℃，12 h晝夜，使用空氣凈化系統(tǒng)，并保持門窗密閉，送風(fēng)機(jī)每隔3 d換濾網(wǎng)1次。飼料及墊料均通過60Co照射處理后使用，每天對動(dòng)物房地面、墻壁及籠具架進(jìn)行清掃，采用紫外線消毒1次。實(shí)驗(yàn)完成后，對處死小鼠的尸體及實(shí)驗(yàn)垃圾進(jìn)行及時(shí)清理與焚燒。將上述小鼠隨機(jī)分為模型組、空白組、高劑量三參生血顆粒治療組(簡稱高劑量組)、中劑量三參生血顆粒治療組(簡稱中劑量組)及低劑量三參生血顆粒治療組(簡稱低劑量組)，每組10只。

2 藥 品 三參生血顆粒由我院藥學(xué)部中藥與天然藥物制劑中心研究制備并提供，配方：丹參、人參、黨參各20 g，黃芪、生熟地、當(dāng)歸、雞血藤、阿膠各10 g，菟絲子5 g，以水煎煮后用蔗糖及淀粉作為輔料進(jìn)行制粒，每劑制備成15 g的顆粒劑；產(chǎn)品批號：2017011091；規(guī)格：15 g/袋；臨床用量為1次/d，1袋/次，折合生藥量為17.47 g。依據(jù)文獻(xiàn)[4]中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體給藥劑量的換算公式，確定本研究中小鼠的劑量，即小鼠劑量(mg/kg)=成人劑量(mg/kg)×12.3，成人體質(zhì)量以60 kg計(jì)，故三參生血顆粒的正常人體劑量為15 g/60 kg=0.25 g/kg，折合每只小鼠正常劑量為0.25 g/kg×12.3=3.075 g/kg，故筆者設(shè)置正常治療劑量(3.075 g/kg)為中劑量組的給藥劑量，設(shè)置兩倍的正常治療劑量(6.15 g/kg)為高劑量組的給藥劑量，設(shè)置0.5倍的正常治療劑量(1.5375 g/kg)為低劑量組的給藥劑量。

3 儀 器 BV767型紫外可見光分光光度計(jì)(安徽奧普勒儀器有限公司)，NHJ-5216K型血細(xì)胞分析儀(日本Nihon Kohoden公司)，CC-8型流式細(xì)胞儀(BD Biosciences公司)，BT-9u型高速離心機(jī)(美國安達(dá)利公司)；60Co照射采用AXESSE型醫(yī)用電子直線加速器(瑞典ELEKTA公司生產(chǎn))。

4 造模及處理方法[5]采用60Co放射源對模型組、高劑量組、中劑量組及低劑量組小鼠進(jìn)行全身照射1次，照射劑量4.5 Gy、照射距離80 cm、照射時(shí)間2 min。照射完成后，對各組小鼠進(jìn)行給藥處理，其中高劑量組、中劑量組及低劑量組小鼠分別灌胃給予6.15 g/kg、3.075 g/kg及1.5375 g/kg的三參生血顆粒，空白組及模型組則給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥15 d。

5 指標(biāo)檢測 ①血象指標(biāo)含量檢測：末次給藥24 h后，采用尾靜脈取血法取各組小鼠靜脈血，檢測其中血象指標(biāo)含量[紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、血小板計(jì)數(shù)(PLT)及血紅蛋白(Hgb)]。②氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測：取一部分上述靜脈血，分離血清，檢測其中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)及過氧化氫酶(CAT)含量。③免疫功能指標(biāo)檢測：取一部分上述靜脈血，采用流式細(xì)胞儀檢測其中CD3+及CD4+含量，采用化學(xué)發(fā)光法檢測其中IgG、IgA及IgM含量。④計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)：取血完成后，采用頸椎脫臼法將各組小鼠處死，取小鼠胸腺和脾臟，計(jì)算胸腺和脾臟指數(shù)，其中胸腺指數(shù)=(胸腺重量/體質(zhì)量)×1000，脾臟指數(shù)=(脾臟重量/體質(zhì)量)×1000。⑤骨髓象指標(biāo)檢測：取小鼠胸骨，選擇中間最紅的骨髓，用止血鉗將其擠出滴落于預(yù)先滴有小牛血清的清潔載玻片上，混勻、推片、固定、晾干，并用新鮮配制的Giemsa染液染色。染色完成后，在鏡下觀察，計(jì)數(shù)1000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞中微核數(shù)，并統(tǒng)計(jì)骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率(‰)。另取小鼠股骨，采用7號針頭將股骨末端刺穿，并用10 ml磷酸鹽緩沖液沖洗骨髓，取4號針頭將沖出的骨髓液過濾待用，取0.5 ml骨髓液滴至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，利用顯微鏡下觀察有核細(xì)胞數(shù)，其中有核細(xì)胞數(shù)(×107個(gè)/L)=稀釋倍數(shù)×4個(gè)大方格有核細(xì)胞總數(shù)÷4×104。

結(jié)果

1 三參生血顆粒對小鼠血象指標(biāo)的影響 見表1。與模型組比較，高劑量組、中劑量組及低劑量組小鼠RBC、WBC、PLT及Hgb含量均顯著降低(P<0.05)。與空白組比較，高劑量組、中劑量組及低劑量組小鼠RBC、WBC、PLT及Hgb含量均顯著增高(P<0.05)。

2 三參生血顆粒對小鼠免疫功能指標(biāo)的影響 見表2。與模型組比，高劑量組、中劑量組及低劑量組小鼠CD3+、CD4+、IgG、IgA及IgM含量均顯著增高(P<0.05)。與空白組比，高劑量組、中劑量組及低劑量組小鼠CD3+、CD4+、IgG、IgA及IgM含量均顯著降低(P<0.05)。

表1 三參生血顆粒對小鼠血象指標(biāo)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05

表2 三參生血顆粒對小鼠免疫功能指標(biāo)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05

3 三參生血顆粒對小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響 見表3。與模型組比，高劑量組、中劑量組及低劑量組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)均顯著增高(P<0.05)。與空白組比，高劑量組、中劑量組及低劑量組小鼠胸腺和脾臟指數(shù)均顯著降低(P<0.05)。

表3 三參生血顆粒對小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響 (%)

注：與模型組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05

4 三參生血顆粒對小鼠骨髓象指標(biāo)的影響 見表4。與模型組比，高劑量組、中劑量組及低劑量組小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率均顯著降低，而有核細(xì)胞數(shù)均顯著增高(P<0.05)。與空白組比，高劑量組、中劑量組及低劑量組小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率均顯著增高，而有核細(xì)胞數(shù)均顯著降低(P<0.05)。

表4 三參生血顆粒對小鼠骨髓象指標(biāo)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05

5 三參生血顆粒對小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 見表5。與模型組比，高劑量組、中劑量組及低劑量組小鼠MDA均顯著降低，而SOD、GSH-PX及CAT均顯著增高(P<0.05)。與空白組比，高劑量組、中劑量組及低劑量組小鼠MDA均顯著增高，而SOD、GSH-PX及CAT均顯著降低(P<0.05)。

表5 三參生血顆粒對小鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)指標(biāo)的影響

注：與模型組比較，*P<0.05；與空白組比較，#P<0.05

討論

放射治療是惡性腫瘤治療的主要方法，然而該治療方法不僅可有效殺滅腫瘤細(xì)胞，對于正常組織及器官亦可造成嚴(yán)重?fù)p傷，引起一系列毒副作用，直接影響到患者的治療效果及生存質(zhì)量[6-7]。研究結(jié)果表明，放射射線可造成機(jī)體大量釋放自由基,而自由基反應(yīng)可激活細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)及炎癥介質(zhì),形成類似于代償性抗炎反應(yīng)綜合征及全身炎癥反應(yīng)綜合征的病理生理改變,從而對非照射區(qū)域及遠(yuǎn)隔部位的組織、器官功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響[8-9]。造血系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)是放射性損傷的高敏感系統(tǒng)，放射線不僅可以抑制紅系祖細(xì)胞、粒系祖細(xì)胞及造血干細(xì)胞的增殖能力，還可降低機(jī)體的體液及細(xì)胞免疫功能，最終引起免疫功能降低、外周血細(xì)胞數(shù)下降、微循環(huán)障礙、骨髓造血系統(tǒng)功能障礙及造血微環(huán)境破壞等病理反應(yīng)[10-11]。因此，改善放射所致造血及免疫系統(tǒng)損傷在提高放射治療效果，改善患者生活質(zhì)量，提高治療耐受性等方面均具有重要意義[12-13]。本研究中，C57BL/6小鼠經(jīng)放射線照射后，全部小鼠均成功造模且未出現(xiàn)小鼠死亡，這表明本研究中所建立的小鼠模型是放射性損傷治療藥物研究的理想模型。

三參生血顆粒是我院常用的院內(nèi)制劑，主要組成藥材包括丹參、黨參、人參、黃芪、生熟地、當(dāng)歸、阿膠、菟絲子、雞血藤等，方中丹參活血補(bǔ)血；黨參善補(bǔ)中氣，以養(yǎng)后天；人參益氣活血；黃芪為治諸氣虛之要藥；生熟地補(bǔ)陰養(yǎng)血；當(dāng)歸補(bǔ)血活血；阿膠補(bǔ)腎益陰；菟絲子補(bǔ)腎陽，益腎陰，以陽護(hù)陰；雞血藤活血化瘀，諸藥共奏益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、生血補(bǔ)血等功效[14-15]。我院多年實(shí)踐證實(shí)，該方劑用于提高癌癥患者免疫功能、提高患者生活質(zhì)量等方面具有較好應(yīng)用價(jià)值，尤其是對于晚期癌癥患者化療所致毒副作用具有較好的改善作用，但目前尚缺乏對該藥物的藥理作用的基礎(chǔ)性研究，而對于其是否可對放射治療所致不良反應(yīng)具有較好的改善作用亦有待證實(shí)。鑒于此，筆者觀察了三參生血顆粒對60Co照射所致C57BL/6小鼠造血及免疫功能的影響，期望為該藥物的臨床新應(yīng)用提供一定的借鑒。

綜上所述，三參生血顆粒對60Co照射所致C57BL/6小鼠造血及免疫系統(tǒng)不良反應(yīng)具有較好的治療作用，其主要機(jī)制可能與該藥物的抗氧化應(yīng)激作用密切相關(guān)。然而筆者對于三參生血顆粒的具體作用機(jī)制的探討仍不夠深入，對于藥物的物質(zhì)基礎(chǔ)尚未進(jìn)行研究，故在后期研究中還應(yīng)對該藥物的詳細(xì)作用機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)探討進(jìn)行深入闡述。