分根裝置中叢枝菌根真菌影響蠶豆秸稈降解作用研究

郭濤，石孝均，朱敏，羅珍

（1.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶400716；2.國家紫色土肥力與肥料效益監(jiān)測基地，重慶400716）

植物凋落物是生態(tài)系統(tǒng)中養(yǎng)分的基本載體，是連接植物與土壤養(yǎng)分循環(huán)的“紐帶”，也是陸地生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換的主要途徑，對生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力至關(guān)重要［1］。凋落物的降解過程是生態(tài)系統(tǒng)的養(yǎng)分循環(huán)中重要的一環(huán)，對整個生態(tài)系統(tǒng)的生物群落構(gòu)建具有重要的作用［2］。植物凋落物的降解過程包括一系列的生物、物理、化學(xué)的作用及它們之間協(xié)同作用，既受植物本身物質(zhì)組成的影響，還受人為活動及環(huán)境等因素的影響，其過程十分復(fù)雜，但本質(zhì)上是一個微生物驅(qū)動的過程［3］。因此，微生物既是土壤的重要組成部分，又是參與凋落物降解的最活躍的生物因素。

在許多陸地生態(tài)系統(tǒng)中，叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌是重要的一類微生物，能與80%以上的陸生植物形成共生體，在各類植物共生微生物中，叢枝菌根真菌是唯一直接聯(lián)系土壤和植物根系的一類，叢枝菌根共生體在生態(tài)系統(tǒng)中可以提高植物對土壤礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收和累積、促進(jìn)植物的抗旱、抗?jié)?、抗鹽、抗病、耐受重金屬脅迫等方面的作用已經(jīng)得到普遍認(rèn)同［4－5］，近年來，叢枝菌根共生體在養(yǎng)分循環(huán)和陸地生態(tài)過程中的作用受到越來越多的關(guān)注，研究AM真菌影響植物凋落物的降解成為研究的主要切入點［6］。雖然真菌通常被認(rèn)為是有機物最主要的分解者，但關(guān)于AM真菌降解植物殘體的研究很少，主要緣于以往的研究普遍認(rèn)為AM真菌專性活體共生，依靠宿主植物提供碳源，不具腐生性，在Hodge等［7］的里程碑式研究中發(fā)現(xiàn)Glomushoi的根外菌絲能利用復(fù)雜的有機質(zhì)中的氮，以13C和15N雙標(biāo)記的研磨后的黑麥草葉作為氮源，并沒有發(fā)現(xiàn)13C隨15N一起轉(zhuǎn)移，說明了AM真菌促進(jìn)叢枝菌根菌絲具有促進(jìn)凋落物降解的能力，拓展了AM真菌在生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)中的作用。

然而叢枝菌根真菌（AMF）如何參與凋落物降解過程的尚不清楚，由于AMF不能像外生菌根真菌和歐石楠科菌根真菌一樣直接分泌胞外酶［8］，菌絲單獨存在時并不能礦化有機質(zhì)［9］，因此叢枝菌根真菌可能通過增加促進(jìn)微生物活性或改變微生物群落來促進(jìn)有機質(zhì)的降解。AM真菌侵染宿主建立共生體系后，一方面菌根菌絲能釋放出多種酶和分泌物，分布于土壤中；另一方面，AM真菌可能增加促進(jìn)微生物活性或改變微生物群落，形成明顯有別于根際的微生物區(qū)系［10］。土壤微生物和酶可能直接或間接的參與到植物殘體的降解過程，據(jù)此推測，在植物殘體降解過程中，AM真菌可直接導(dǎo)致土壤微環(huán)境的優(yōu)化。

目前為止，國內(nèi)外關(guān)于AM真菌對植物殘體降解的影響研究還不深入，因此，研究過程中采用了四室分根裝置，將植物的根系、菌根以及根外菌絲隔開，通過分別比較其對蠶豆（Viciafaba）秸稈降解的影響，以及土壤中微生物和酶活性的變化動態(tài)，旨在植物生長狀況相同的前提下，對植物根系、菌根和菌絲及根外菌絲降解蠶豆秸稈的作用進(jìn)行量化比較。深入理解AM真菌在促進(jìn)植物凋落物降解中的作用。研究AM真菌對植物凋落物降解的影響，初步揭示AM真菌在植物殘體降解過程中的作用，對理解AM真菌在生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)中有重要意義，也為進(jìn)一步闡述其在生態(tài)系統(tǒng)中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院植物營養(yǎng)實驗室進(jìn)行。供試土壤為中性紫色土，其基本理化性狀為：pH 6.9、有機質(zhì)21.5g/kg、全氮0.6g/kg、全磷1.0g/kg、全鉀15.4g/kg、堿解氮84.2mg/kg、有效磷27.6mg/kg、速效鉀73.0mg/kg。土壤經(jīng)濕熱滅菌處理，風(fēng)干后備用。

供試植物：玉米（Zeamays）“精科糯2000”，種子以10%濃度的H2O2表面消毒10min，去離子水浸泡5h，于25℃暗室催芽30h后，在盛有石英砂的培養(yǎng)盆中育苗，隨時補充水分和養(yǎng)分，待根系長出8～10cm時進(jìn)行分根。

供試AM真菌菌種：Glomusmosseae（G.m），來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，經(jīng)三葉草（Trifoliumrepens）、玉米盆栽繁殖，接種劑含有AM真菌孢子、根外菌絲和侵染的根段，每克菌劑含有20～30個孢子。

蠶豆秸稈尼龍網(wǎng)袋制備：試驗材料為蠶豆成熟后的地上部秸稈，用去離子水漂洗，于60℃下烘干至恒量，磨碎后過篩，使粒徑為0.5～2mm。稱取2.00g材料分別裝入孔徑為75μm，長9cm，寬5cm的尼龍網(wǎng)袋中。封口后稱整個網(wǎng)袋重量，用萬分之一天平精確到小數(shù)點后4位。其初始元素含量為：全碳457.3g/kg、全氮20.74 g/kg、碳氮比22.05。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗所用裝置參照彭思利等［11］的四室隔板分室系統(tǒng)，分別稱之為菌根室（M）、菌絲室（H）、非根際土壤室（S）、根室（R）。此裝置采用3mm厚的有機玻璃板加工而成，每個室的長×寬×高均為：5cm×10cm×15cm。M室和R室用長14cm，寬10cm，厚3mm的有機玻璃隔板隔開，而S室和R室以及H室和 M室則由37.4 μm（400目）的尼龍網(wǎng)隔開，菌絲和溶液能透過此尼龍網(wǎng)，而根系則不能。每盆土重共計3.6kg，每室盛土0.9 kg，試驗進(jìn)行時，先分別向4個分室中加0.20kg滅菌土壤，然后分別豎放置一個尼龍網(wǎng)袋，然后在M室加入與接種劑均勻混合的0.5kg土壤，接種量為10%，R室則加入等量滅菌的菌種與土壤混合，以保持土壤理化性質(zhì)一致（不接種的對照處理）。將植物根系平均分為2份置于中間兩室中，每盆定植2株玉米，上面再覆蓋0.20kg滅菌土壤。S室與H室加入的土壤與R、M室相同。試驗過程中采用稱重法保持水分含量，使每室土壤含水量保持在田間持水量的60%～70%。試驗共設(shè)置15個分室裝置，每個處理5個重復(fù)。試驗過程中土壤未施肥。試驗于2012年3月至2012年6月在西南大學(xué)植物營養(yǎng)網(wǎng)室進(jìn)行。

根據(jù)AM真菌侵染規(guī)律，將取樣時間分別設(shè)定在移栽后第20、30、40、50、60天時，每處理收獲3盆，根室與菌根室中根系分開收獲，取洗凈、混勻的鮮根1g用于侵染率的測定，取出的尼龍網(wǎng)袋于40℃烘干至恒重，用萬分之一天平稱重。土壤風(fēng)干后待測。

1.3 測定項目及方法

每個尼龍網(wǎng)袋單獨測定：降解量＝B0－Bt。式中，B0為蠶豆秸稈初始重量，Bt為蠶豆秸稈剩余重量。網(wǎng)袋內(nèi)剩余蠶豆秸稈的C含量測定方法為重鉻酸鉀－硫酸法，N含量測定方法為凱氏定氮法［12］；C釋放量與N釋放量參照申艷等［13］的方法計算；應(yīng)用Olson的指數(shù)模型Bt/B0＝e－kt計算玉米秸稈的降解系數(shù)k值［14］。玉米根系的菌根侵染率采用方格交叉法測定［15］。土壤菌絲密度按照Abbott等［16］的方法進(jìn)行。

土壤過氧化氫酶活性測定采用高錳酸鉀滴定法，活性單位以30min后1g土壤消耗0.1mol/L KMnO4的毫升數(shù)表示（U）；蛋白酶活性測定采用茚三酮比色法，活性單位以24h后1g土壤中氨基氮的毫克數(shù)表示（U）［17］；酸性磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法，活性單位以3h后100g土壤中酚的毫克數(shù)表示（U）［18］；土壤呼吸強度測定采用堿吸收法；微生物量碳、氮測定采用氯仿熏蒸－K2SO4浸提法［19］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)在Excel中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，應(yīng)用SAS軟件（Version 9.13；SAS Institute，Cary，NC）對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，5%水平下LSD多重比較檢驗各處理平均值之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物與菌根結(jié)構(gòu)生長情況

從表1可以看出，接種G.m的M室形成了良好的菌根共生體，并且隨著時間的延長，侵染率和菌絲密度不斷增加，根系侵染率在60d時為78.85%，而不接種的R室均未形成菌根共生體。由于AM真菌根外菌絲可以通過M室和H室之間的尼龍網(wǎng)到達(dá)H室，在M室和H室均有大量的菌絲，60d時菌絲密度在76.27～102.63 cm/g之間，M室最高，R室和S室沒有菌絲存在。M室和R室根系生物量除60d時差異均不顯著（表2）。

表1 分根裝置中接種菌根真菌的宿主植物根系侵染率及菌絲密度Table 1 Inoculation rate and hyphal density of non－mycorrhizal and mycorrhizal host plants in the split－root device

表2 分根裝置中接種菌根真菌的宿主植物地上部、根系干重Table 2 Shoot dry weight，root dry weight of non－mycorrhizal and mycorrhizal host plants in the split－root device g

2.2 接種AM真菌對蠶豆秸稈降解的影響

如表3所示，各室降解量隨著培養(yǎng)時間的增加而增加。在相同取樣時間，各室的蠶豆秸稈降解量有顯著差異，且均表現(xiàn)為：M室＞R室＞H室＞S室，即同一宿主植物條件下，與根系相比，前期菌根系土壤環(huán)境對蠶豆秸稈的降解有明顯優(yōu)勢，而后期這一優(yōu)勢變緩；60d時，與S室相比，R室、M室和H室蠶豆秸稈降解量分別提高了15.61%，20.54%和7.74%。由此可見，接種G.m的M室不僅有提高蠶豆秸稈降解率的趨勢，而且當(dāng)一定數(shù)量的根外菌絲進(jìn)入到H室后，也加快了蠶豆秸稈降解，但菌絲的作用仍不及根系。

表3 接種AM真菌對蠶豆秸稈降解量的影響Table 3 Effect of AM fungi inoculation on degradation mass of vicia faba straw g

降解系數(shù)是衡量分解速率的一個指標(biāo)，降解系數(shù)越大其分解速度就越快。由圖1可以看出，各室蠶豆秸稈的降解系數(shù)隨時間的增加逐漸減小，即蠶豆秸稈的降解速度到后期越來越緩慢；且同一取樣時期，各室降解系數(shù)均為：M室＞R室＞H室＞S室；植物生長到60d時，R室、M室和H室的降解系數(shù)比S室分別高出25.87%、35.00%和12.17%。說明接種 AM 真菌能加快蠶豆秸稈的降解速度，并帶動菌絲的作用，但根系的影響卻不容忽視，這與表3中接種AM真菌處理增加蠶豆秸稈降解量結(jié)果相一致。

圖1 接種AM真菌對蠶豆秸稈降解系數(shù)的影響Fig.1 Effect of AM fungi inoculation on degradation coefficient of vicia faba straw

2.3 接種AM真菌對蠶豆秸稈C、N釋放量及C/N的影響

如表4所示，各室蠶豆秸稈中碳素隨時間延長表現(xiàn)為凈釋放特性，即C釋放量不斷增加；60d時，R室、M室和 H室較S室相比，C釋放量增加了16.06%、21.09%、8.35%，以 M 室為最高；對于 C釋放量，同一取樣時期四室均表現(xiàn)出相同的趨勢：M室＞R室＞H室＞S室。在整個培養(yǎng)過程中，氮素釋放規(guī)律也表現(xiàn)為隨時間逐漸增加。60d時，R室、M室和H室較S室相比，N釋放量提高了6.17%、7.46%、1.10%，以 M 室為最高。由此可見，接種AM真菌對蠶豆秸稈中碳、氮釋放均有促進(jìn)作用。

蠶豆秸稈中碳素與氮素釋放量的不同必然引起C/N的變化。圖2反映了蠶豆秸稈降解過程中C/N的變化動態(tài)。可以看出，整個降解過程中，除S室外，包埋與其他分室中的蠶豆秸稈C/N與初始值相比，都顯著下降，尤以M室下降最多。

表4 接種AM真菌對蠶豆秸稈C、N釋放量的影響Table 4 Effect of AM fungi inoculation on C release and N release of vicia faba straw

2.4 接種AM真菌對土壤中酶活性的影響

圖3分別為土壤中酸性磷酸酶、蛋白酶和過氧化氫酶的活性。結(jié)果顯示，AM真菌菌絲能通過與細(xì)菌的協(xié)同作用來提高磷酸酶活性，促進(jìn)有機磷化合物的水解，以活化植物通常不能直接利用的有機磷源。整個過程中各處理的酸性磷酸酶活性均表現(xiàn)為先升高后下降的趨勢，以40d時M室為最高；在相同取樣時期，四室中M室始終顯著高于其他三室，且H室高于S室。

蛋白酶是水解酶類的一種，它參與土壤中氨基酸、蛋白質(zhì)及含氮有機化合物的酶解，可將蛋白質(zhì)水解為肽，最終形成氨基酸為植物提供氮源。如圖3所示，蛋白酶活性總體表現(xiàn)為波浪式變化，且在30d時均有一定程度下降；但在相同取樣時期，四室均表現(xiàn)為相同的趨勢，M室＞R室＞H室＞S室。

過氧化氫酶能解除由生物呼吸和生物化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生的過氧化氫的毒害，參與土壤中物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化，其活性表示土壤腐質(zhì)化強度大小和有機質(zhì)積累程度。圖3可以看出，對于過氧化氫酶活性，在相同取樣時期四室均表現(xiàn)為相同的趨勢，M室＞R室＞H室＞S室。

圖2 接種AM真菌對蠶豆秸稈C/N的影響Fig.2 Effect of AM fungi inoculation on C/N ratio of vicia faba straw

2.5 接種AM真菌蠶豆秸稈降解過程中土壤微生物量碳、氮的動態(tài)變化

表5數(shù)據(jù)可以看出，接種與否對土壤微生物量碳、氮產(chǎn)生很大影響。整個培養(yǎng)過程中，同一時期四室的微生物量碳均表現(xiàn)為M室最高，60d時比S室、R室和 H室分別高出109.70%、59.75%和59.19%。微生物量氮也是如此，60d時接種G.m的M室最高，比S室、R室和 H 室分別高出64.02%、23.38%和29.44%。

2.6 接種AM真菌蠶豆秸稈降解過程中土壤呼吸與呼吸熵的動態(tài)變化

土壤呼吸（soil respiration）是評價土壤基質(zhì)中碳穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，同時也反映了土壤微生物的活性。表6數(shù)據(jù)表明，同一取樣時間下，接種G.m的菌根室土壤呼吸均高于相應(yīng)不接種的根室。因此可以認(rèn)為，接種AM真菌相對提高了土壤中的微生物活性。對土壤呼吸熵（respiration quotient，qCO2）而言，接種G.m的菌根室有所下降，均低于相應(yīng)不接種的根室。

圖3 分根裝置中接種AM真菌對土壤酶活性的影響Fig.3 Effect of AM fungi inoculation on soil enzymatic activity in the split－root device

表5 分根裝置中接種AM真菌對土壤微生物量碳、氮的影響Table 5 Effect of AM fungi inoculation on soil microbial biomass carbon and nitrogen in the split－root device mg/kg

表6 分根裝置中接種AM真菌對土壤呼吸及呼吸熵的影響Table 6 Effect of AM fungi inoculation on soil respiration and qCO2in the split－root device

3 討論

本試驗采用四室分根裝置，在同一宿主植物的前提下，通過比較非根際土壤室（S）、根際土壤室（R）、菌根際土壤室（M）和菌絲際土壤室（H）中土壤酶活性、微生物量碳、氮以及土壤呼吸的變化動態(tài)，分析了其對蠶豆秸稈降解的影響。

結(jié)果表明，接種G.m的M室與S室、R室和H室相比，顯著促進(jìn)了蠶豆秸稈的降解，已有的研究也發(fā)現(xiàn)AM真菌侵染形成共生體系后，會引起植物殘體降解速率發(fā)生變化［20－22］。在本試驗為期60d的試驗過程中，根室的降解作用均高于只有菌絲的H室，但顯著低于M室，在一定程度上說明根系在植物殘體降解過程中的作用超過了單獨的菌絲作用，但還是小于菌絲和根系共同的作用（表3）。

由于AM真菌不能像外生菌根真菌和歐石楠科菌根真菌一樣直接分泌胞外酶［8］，菌絲單獨存在時并不能礦化植物的凋落物［9］，因此叢枝菌根真菌可能通過增加參與有機質(zhì)降解過程中的各種土壤的酶活性來促進(jìn)有機質(zhì)的降解［6，23－25］。本研究數(shù)據(jù)表明，接種AMF后，顯著提高了M室中土壤中酸性磷酸酶、蛋白酶和過氧化氫酶活性，且H室的酶活性相對于S室也有顯著提高，這些酶可能參與蠶豆秸稈的降解過程，進(jìn)而影響了秸稈的降解。作為土壤中生化反應(yīng)的調(diào)控者，土壤酶在土壤氮素循環(huán)和有機質(zhì)的形成扮演著重要角色［26］，影響土壤中的各種代謝過程和能量轉(zhuǎn)化，并能參與土壤中有機物質(zhì)的分解和轉(zhuǎn)化，這是AM真菌加快植物殘體降解的原因。另外，AM真菌還促使某些腐生微生物在植物殘體附近快速繁殖［27］，并緩慢釋放易利用的有機碳輔助其生長［28］。因此接種AM真菌會引起土壤微生物量、區(qū)系組成以及代謝過程發(fā)生變化［29］，主要表現(xiàn)為M室微生物量碳、氮和土壤呼吸相對于其他三室均有增加（表6），且H室相比S室，微生物量的大小和活性均有提高，利于土壤微生物質(zhì)量的穩(wěn)定與提高［30］，可能成為蠶豆秸稈降解加快的重要驅(qū)動力。

菌根室土壤呼吸（表6）相對于根室均明顯增加。土壤呼吸熵，又稱微生物代謝熵（qCO2），能夠反映土壤微生物種群利用土壤有機成分的效率，還可以同時表示微生物量的大小和活性［31］。qCO2值越低表明微生物碳利用效率就越高［32］。這些數(shù)據(jù)證實菌根室中的微生物量大小和活性相對根室均有提高，進(jìn)而對蠶豆秸稈的降解產(chǎn)生影響。

植物凋落物的C/N是影響秸稈降解的重要因素［33］，一般認(rèn)為，較低的C/N有利于凋落物中礦質(zhì)態(tài)養(yǎng)分的釋放［34］。結(jié)果顯示，包埋于M室的蠶豆秸稈降解速率最快，同時C/N與初始值相比，顯著下降，說明了隨著降解的進(jìn)行，接種AM真菌的M室顯著降低了玉米秸稈C/N，使其更易于降解。原因可能有兩個，一是秸稈中碳素與氮素不同程度釋放，進(jìn)而影響了秸稈C/N的變化；二是在分室裝置的M室中分布著大量的菌絲，而菌絲的氮含量可高達(dá)5%［21］，加之AM真菌具有在有機質(zhì)斑塊中富集生長的特性［35］，造成包埋于M室中的蠶豆秸稈氮總量的增加，從而降低了C/N。

本研究結(jié)果表明接種叢枝菌根真菌能夠顯著加快蠶豆秸稈降解，源于AM真菌和宿主植物形成共生體系后，通過提高土壤酶活性、增加微生物量的大小和活性作用于蠶豆秸稈的降解過程，成為導(dǎo)致蠶豆秸稈降解加快的重要原因，同時菌絲的大量生長造成局部C/N的下降從而有利于蠶豆秸稈的進(jìn)一步降解也是一個重要的因素；在進(jìn)一步的研究過程中，將重點研究菌根際或者菌絲際參加植物凋落物降解的微生物功能群落的變化［25］，以進(jìn)一步闡明叢枝菌根影響凋落物降解的作用機制及其在生態(tài)系統(tǒng)碳氮循環(huán)中的作用。

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