冠心病P2Y12基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗的相關(guān)性研究

王珣 張遠(yuǎn)恒 張弛

(1.武漢市第三醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430060；2.武漢科技大學(xué)附屬普仁醫(yī)院心內(nèi)科，湖北 武漢 430081)

冠心病是臨床常見(jiàn)的心血管疾病之一，近年來(lái)隨著高血壓、糖尿病等基礎(chǔ)性疾病發(fā)病率的上升，冠心病的發(fā)病率也呈現(xiàn)出逐步上升的趨勢(shì)。冠心病會(huì)導(dǎo)致患者不良心血管事件的發(fā)生。對(duì)冠心病患者進(jìn)行介入治療，能夠改善患者的臨床轉(zhuǎn)歸。氯吡格雷能夠在改善冠心病介入治療后的高凝狀態(tài)等方面發(fā)揮積極作用，可有效降低介入術(shù)后血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。不同等位基因位點(diǎn)的改變，會(huì)影響到冠心病介入治療患者的遠(yuǎn)期抗血小板治療效果、凝血功能障礙及繼發(fā)性血小板性血栓的形成，進(jìn)而影響到臨床治療結(jié)局[3-5]。為了揭示不同的等位基因多態(tài)性的改變對(duì)冠心病介入治療后血小板抵抗的影響，本次研究選取300例冠心病介入治療后采用氯吡格雷進(jìn)行抗血小板治療的患者作為研究對(duì)象，探討P2Y12基因G52T多態(tài)性位點(diǎn)與氯吡格雷抵抗的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2013年1月至2016年1月在我院進(jìn)行介入治療后采用氯吡格雷進(jìn)行抗血小板治療的冠心病患者300例為研究對(duì)象，根據(jù)血小板聚集率不同分為氯吡格雷抵抗組(抵抗組)43例、非氯吡格雷抵抗組(非抵抗組)257例。抵抗組中男25例、女18例；年齡48～79歲，平均(62.3±10.7)歲。非抵抗組中男140例、女117例，年齡44～79歲，平均(63.6±12.4)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考人民衛(wèi)生出版社第八版《內(nèi)科學(xué)》、美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)(AHA)/美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)(ACC)制定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；(2)患者經(jīng)冠脈造影檢查確診為冠心??；(3)在我院接受介入治療，采用氯吡格雷進(jìn)行抗血小板治療；(4)患者的臨床基線資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有腫瘤疾病者；(2)近一周使用GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑治療者；(3)患者接受抗血小板治療前的血小板計(jì)數(shù)<100×109/L；(4)伴有嚴(yán)重的心功能、肝腎功能障礙者；(4)伴有消化道出血、貧血者；(5)伴有甲狀腺功能疾病者。兩組患者的性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2收集資料及分組方法 收集所有納入對(duì)象的年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、吸煙史、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、伴隨疾病情況、冠脈病變支數(shù)。分組方法：ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率較基線水平降低<10%或氯吡格雷維持治療是血小板聚集率>50%的患者為氯吡格雷抵抗組。未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)的患者為非氯吡格雷抵抗組。

1.3P2Y12基因多態(tài)性檢測(cè) 取凍存的血清保存液體，按照10 000 r/min的離心速度進(jìn)行離心分離，每1 mL的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 mL的氯仿，進(jìn)行裂解操作，4℃冰上采用無(wú)酶的RNA沖洗液進(jìn)行洗滌，再次10 000 r/min離心5 min，得到RNA?；旌弦涸诩尤肽孓D(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3 min，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，37℃水浴60 min，室溫放置5 min使其完全溶解，使其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以β-actin為模版，在反應(yīng)體系中加入SYBR Green 1 染料、上游引物、下游引物、dNTP，使得總體積達(dá)20 μL，上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃ 2 min、93℃ 1 min、55℃ 2 min，共40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1兩組患者的資料比較 兩組患者的年齡、性別、吸煙率、HDL-C、TG、合并高血壓疾病率、冠脈病變支數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；抵抗組患者的LDL-C、TC、HbA1c、糖尿病合并率均顯著的高于非抵抗組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者資料比較

2.2兩組患者的P2Y12基因G52T多態(tài)性及等位基因頻率比較 抵抗組患者的P2Y12基因G52T多態(tài)性中GT、TT顯著高于非抵抗組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；抵抗組患者的等位基因頻率T顯著高于非抵抗組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者的P2Y12基因G52T多態(tài)性及等位基因頻率比較[n(%)]

2.3氯吡格雷抵抗與P2Y12基因G52T多態(tài)性的關(guān)系 以是否發(fā)生氯吡格雷抵抗作為因變量，P2Y12基因G52T多態(tài)性、LDL-C、TC、糖尿病合并率作為自變量進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示：P2Y12基因G52T位點(diǎn)GT、TT頻率增高OR(95%CI)=2.048(1.574～7.028)(P<0.05)，合并糖尿病是氯吡格雷抵抗的危險(xiǎn)因素OR(95%CI)=1.776(1.309～4.881)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 氯吡格雷抵抗與P2Y12基因G52T多態(tài)性Logistic回歸分析

3 討 論

冠心病是由于心臟血管血流供應(yīng)障礙導(dǎo)致心肌細(xì)胞的缺血性壞死，從而致使心血管系統(tǒng)發(fā)生難以逆轉(zhuǎn)的病理改變。氯吡格雷抗血小板治療，一方面能夠改善患者血小板高凝狀態(tài)導(dǎo)致的繼發(fā)性血栓的形成，另一方面可以改善局部?jī)?nèi)皮損傷或者冠心病本身等高危因素導(dǎo)致的血栓形成。但較高的血小板抵抗仍然是目前臨床上影響氯吡格雷治療效果的主要因素，過(guò)高的血小板抵抗加劇了患者心血管系統(tǒng)不良臨床預(yù)后的發(fā)生[6-7]。

P2Y12基因是影響血小板聚集或者表面活化的重要因素，過(guò)度的P2Y12基因的激活，可以對(duì)患者的血小板的富集或者纖維蛋白的交鎖等發(fā)揮作用。而P2Y12基因多態(tài)性可以影響半胱氨酸及含巰基氨基酸的代謝，導(dǎo)致中間代謝產(chǎn)物的上升，并影響到血小板聚集的程度，促進(jìn)血小板性血栓的形成，并可影響到血小板的穩(wěn)定性，促進(jìn)血栓脫落[8-9]。同時(shí)，P2Y12基因多態(tài)性可以引起TG、TC及HDL等血脂指標(biāo)的代謝異常，增加血小板表面活化因子b的合成，促進(jìn)了血小板表面蛋白ⅡB的表達(dá)，促進(jìn)了血小板抵抗的形成[10-11]。已有的研究探討了其他位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)于氯吡格雷抵抗的影響的，但迄今為止缺乏對(duì)于P2Y12基因G52T多態(tài)性的相關(guān)研究。

在發(fā)生氯吡格雷抵抗的患者血清中，可以通過(guò)RNA相關(guān)檢測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)P2Y12基因G52T多態(tài)性存在明顯的等位基因的表達(dá)差異，其中P2Y12基因G52T多態(tài)性GT或者TT等位基因的表達(dá)差異較為明顯，明顯高于氯吡格雷非抵抗組，提示GT或者TT等位基因的問(wèn)題可能影響到了氯吡格雷抗血小板的臨床效果，從機(jī)制上考慮，P2Y12基因G52T多態(tài)性的GT或者TT等位基因的差異，可以通過(guò)影響下列幾個(gè)方面的機(jī)制導(dǎo)致氯吡格雷抵抗的發(fā)生[12-13]：(1)GT或者TT的高表達(dá)，促進(jìn)了P2Y12蛋白翻譯過(guò)程中末端巰基結(jié)構(gòu)的合成或者修飾，導(dǎo)致P2Y12蛋白的四級(jí)空間結(jié)構(gòu)受到了一定的影響；(2)GT或者TT的高表達(dá)，能夠在影響局部血小板表面蛋白IIB或者IA的配體結(jié)合活性，或者加劇血小板的粘附能力等方面形成一定的生理效果，從而影響血小板抵抗的發(fā)生。刑元[14]，吳小利等[15]研究者在探討了大樣本量的臨床多中心臨床數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，發(fā)生氯吡格雷抵抗的患者中，相關(guān)等位基因的表達(dá)差異較為明顯，特別是等位基因GT的表達(dá)增加，促進(jìn)了患者氯吡格雷的高劑量或者長(zhǎng)時(shí)間治療結(jié)局的發(fā)生，加劇了氯吡格雷抵抗的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在探討其他因素對(duì)于氯吡格雷抵抗的影響過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，抵抗組患者的血清中可以發(fā)現(xiàn)其具有明顯的血脂或者血糖代謝紊亂，特別是LDL-C、TC、HbA1c等可能在影響氯吡格雷的半衰期或者氯吡格雷的肝臟代謝等方面發(fā)揮作用，促進(jìn)患者氯吡格雷治療過(guò)程中抵抗的發(fā)生。最后，相關(guān)的危險(xiǎn)因素回歸分析也可見(jiàn)，GT、TT頻率增高、合并糖尿病及血脂異常是影響氯吡格雷抵抗的主要因素，進(jìn)一步提示了等位基因的表達(dá)差異對(duì)于氯吡格雷抵抗的影響。