郭艷紅 鐘惠敏 周龍書
(廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦科,廣東 廣州 510000)
卵巢癌是一種惡性程度高、治療難度大的婦科腫瘤。受卵巢在體內(nèi)所處的位置及卵巢癌的生物學特性的影響,卵巢癌的早期診斷比較困難[1]。因而,尋找卵巢癌早期發(fā)病的相關指標,對疾病的早期診治及患者的預后有著積極意義。新近發(fā)現(xiàn),clusterin和septin-9蛋白可能與卵巢癌的發(fā)病存在一定的相關性。其中,clusterin蛋白是一種抗凋亡蛋白,在多種器官和組織中均有表達。目前已發(fā)現(xiàn),clusterin蛋白的高表達與肺癌、乳腺癌等有關[2]。編碼septin-9蛋白的septin-9基因位于染色體17q25.3,亦被稱之為ovarian/breast(Ov/Br)septin基因,目前認為其發(fā)揮了原癌基因的作用[3]。CA125是一項臨床常用的腫瘤指標,對消化系統(tǒng)及婦科等腫瘤具有較高的敏感性。筆者擬在傳統(tǒng)腫瘤指標CA125基礎上聯(lián)合clusterin和septin-9基因/蛋白的檢測,以分析其與卵巢癌患者早期診斷及預后判斷的相關性。現(xiàn)報告如下。
1.1一般資料 選擇我院婦產(chǎn)科2016年5月至2018年1月收治的明確診斷為卵巢癌的患者62例為觀察組。另選擇同期健康體檢者31例為對照組。觀察組年齡35~48歲,平均(41.25±6.28)歲;FIGO分級Ⅰ~Ⅱ期的患者共33例;Ⅲ~Ⅳ期的患者29例;其中未分化者5例,低分化者28例,中分化者10例,高分化者19例;發(fā)生遠處轉移者22例,無遠處轉移者40例,發(fā)生淋巴結轉移者21例,未發(fā)生淋巴結轉移者41例。對照組年齡35~49歲,平均(41.62±6.64)歲。納入標準:經(jīng)病理證實為卵巢癌并采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(FIGO)分期;未接受化療、放療及生物治療等;預計生存期≥6個月。排除標準:卵巢轉移性癌;合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤者。兩組患者基線資料間未見明顯差異(P>0.05),具有可比性。
1.2試劑與方法
1.2.1試驗試劑及儀器 試劑:Trizol試劑(購自美國Invitrogen公司)、RNA提取試劑盒(購自德國Miltenyi Biotec公司)、逆轉錄和PCR試劑盒(均購自美國 Invitrogen 公司)、引物合成(上海生工公司)、人clusterin ELISA試劑盒(購自美國LIFEKEY公司)、人septin-9 ELISA試劑盒(購自美國ABNOVA公司)、CA125采用化學發(fā)光法檢測。儀器:ABI 7300型實時定量熒光PCR儀。
1.2.2方法 (1)抽取患者外周血于4℃條件下,1 500 g離心力下離心15 min,取上層血漿分裝保存于-80℃冰箱以備用。(2)采用qRT-PCR方法檢測基因表達水平采用TRIZOL試劑提取總RNA。采用逆轉錄試劑盒合成cDNA。以β-catin為內(nèi)參基因,采用ABI 7 300型PCR儀將轉錄成的cDNA在50℃、2 min,95℃、15 min,95℃、15 s,60℃、1 min,共40個循環(huán)條件下擴增。每次循環(huán)均設空白對照,計算目的基因 mRNA的相對表達量,每組重復 3 次取均值。PCR產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳分析并鑒定?;蛳鄬Ρ磉_量采用△△Ct法進行計算,△△Ct=(Ct目的基因-Ctβ-catin)觀察組-(Ct目的基因-Ctβ-catin)對照組,觀察組標本相對表達量為2-△△Ct。引物序列見表1。(3)按照ELISA試劑盒說明書,分別檢測血漿中clusterin和septin-9蛋白水平。
表1 引物序列
2.1兩組患者clusterin和septin-9 mRNA表達水平比較 經(jīng)過檢測顯示,觀察組患者外周血中clusterin和septin-9 mRNA相對表達量分別為(1.67±0.81)、(1.93±0.22);外周血中clusterin和septin-9 蛋白相對表達量分別為(133.26±16.31)、(633.29±28.61)。與對照組相比,觀察組患者外周血中clusterin和septin-9 Mrna/蛋白表達量均顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
2.2兩組患者外周血CA125表達水平比較 與對照組(37.91±11.84) kU/mL相比,觀察組患者外周血中CA125表達量(279.36±36.14) kU/mL顯著升高(t=5.338,P=0.011<0.05)。
2.3外周血clusterin、septin-9及CA125表達水平與疾病相關性 分別比較不同病理分期、是否遠處轉移(包括淋巴結轉移)及不同分化程度患者間clusterin、septin-9及CA125表達水平發(fā)現(xiàn):Ⅰ~Ⅱ期卵巢癌患者與Ⅲ~Ⅳ期卵巢癌患者相比,clusterin基因/蛋白及CA125水平顯著降低(P<0.05),而septin-9基因/蛋白表達水平間未見明顯差異;未發(fā)生遠處轉移(包括淋巴結轉移)者較發(fā)生遠處轉移(包括淋巴結轉移)者,其septin-9基因/蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),而clusterin基因/蛋白及CA125間未見明顯差異;不同分化程度患者間clusterin、septin-9及CA125表達水平均未見明顯差異。見表2。
表2 不同病理分期、是否遠處轉移及不同分化程度患者間clusterin、septin-9及CA125表達水平差異
卵巢癌是婦女第五常見的惡性腫瘤。卵巢惡性腫瘤死亡率居高不下的原因主要在于約占卵巢原發(fā)惡性腫瘤總數(shù)80%~90%的卵巢上皮性癌在早期時癥狀不明顯,沒有有效的早期篩查手段,臨床上早期難以發(fā)現(xiàn),發(fā)現(xiàn)時常常已經(jīng)是晚期,而晚期卵巢癌即使經(jīng)過規(guī)范化治療,在治療后3年內(nèi)多數(shù)仍會出現(xiàn)復發(fā)、轉移和耐藥,患者預后很差,5年生存率僅為20%左右[4-6]。因此,尋找早期的診斷指標對卵巢癌患者的診斷、治療及遠期預后具有重要意義。傳統(tǒng)的腫瘤指標主要包括糖類蛋白等,其中CA125對消化系統(tǒng)及婦科系統(tǒng)來源腫瘤具有較高的他特異性,但在疾病早期缺乏敏感。相關指標明顯升高時,往往原發(fā)病已顯著進展。因而,單純依靠現(xiàn)有的腫瘤監(jiān)測指標遠不能滿足包括卵巢癌在內(nèi)的惡性腫瘤性疾病的診治需求。
septin-9定位于染色體17q25.3,是體內(nèi)重要的原癌基因之一[7]。體外研究[8-9]發(fā)現(xiàn),在人細胞系的AffymetrixHG U133基因芯片檢測結果表明,septin-9在乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、子宮內(nèi)膜、腎臟、肝、肺、淋巴、食管、卵巢、胰腺、軟組織、皮膚、甲狀腺等來源的腫瘤中高表達。clusterin基因定位于染色體8p21-p12,其編碼的蛋白參與了多種重要生理功能,包括精子成熟、膜再生、脂類轉運、組織分化和重塑、補體抑制、細胞.細胞及細胞.細胞外基質相互作用、炎癥、細胞運動、分子伴侶、細胞氧化應激、細胞增殖、細胞凋亡等[10-15]。近年來研究[16-18]發(fā)現(xiàn),clusterin除作為胞外分子伴侶發(fā)揮使應激性蛋白變穩(wěn)定的作用外,也是一種凋亡相關蛋白,參與到細胞程序化死亡過程中,該蛋白在腫瘤性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到一定的促進作用。然而有關septin-9/clusterin基因及其轉錄的蛋白水平與卵巢癌發(fā)生及進展過程是否相關,相關報道較少。本組資料中,在觀察組患者中septin-9及clusterin基因/蛋白表達的水平較對照組顯著升高,提示這兩種基因/蛋白可能參與了卵巢癌發(fā)病過程,在進一步的分析中發(fā)現(xiàn),病理分期晚期的患者中,其clusterin基因/蛋白及CA125表達水平較早期患者顯著升高,提示clusterin聯(lián)合CA125檢測對早期卵巢癌的診斷具有一定的意義。而通過對原發(fā)腫瘤轉移情況分析發(fā)現(xiàn),septin-9基因/蛋白在發(fā)生遠處轉移的患者中明顯升高,這表明septin-9的高表達可協(xié)助提供腫瘤進展的證據(jù)。
綜上所述,卵巢癌患者外周血中clusterin、septin-9及CA125水平較正常人群均顯著升高,其中clusterin和CA125表達增高者可能提示病理分期較高,septin-9表達增高考慮存在原發(fā)病的遠處轉移可能。然而,受到樣本量等客觀因素的限制,數(shù)據(jù)偏倚在所難免,相關因素的長期作用尚需進一步研究。