DPPH法測(cè)定樹上蝦丙酮部位自由基清除能力

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(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.廣西師范學(xué)院 化學(xué)與材料學(xué)院，廣西 南寧 530001；3.廣西南寧市第五十六中學(xué)，廣西 南寧 530001)

活性氧在許多疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，如呼吸窘迫綜合征、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、局部或全身炎癥性疾病、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、癌癥和神經(jīng)退行性疾病[1-3]?；钚匝?ROS)在正常氧化代謝過程中不斷在人體內(nèi)形成，并通過由具有抗氧化活性的酶組成的內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)清除。但外源性細(xì)胞中活性氧由外源源形成或未被充分去除，則可能發(fā)生氧化應(yīng)激。因此，抗氧化劑特別是天然抗氧化劑的清除作用受到廣泛關(guān)注[4-5]。本實(shí)驗(yàn)通過冷浸法得到樹上蝦丙酮提取物，采用DPPH和羥自由基體系，評(píng)估其對(duì)自由基清除能力。

1 材料與儀器

UV1901型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析電子科技有限公司)；樹上蝦藥材購(gòu)于廣西百色；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于百靈威試劑公司(北京)。所有試劑均為分析純。

2 方法

2.1 樹上蝦丙酮提取物制備

稱取20 g樹上蝦粉末，加入200 mL丙酮(95%)，冷浸72 h。重復(fù)上述操作3次，合并提取液。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到樹上蝦丙酮提取物。

2.2 總黃酮含量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液(l mg/mL)于10 mL量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉0.4 mL，靜置6min，加入5%硝酸鋁0.4 mL，靜置6 min。加5%氫氧化鈉試液4.0 mL，用95%丙酮稀釋至刻度，搖勻。靜置15 min，在510 nm處測(cè)定吸收度。以吸收度對(duì)溶液濃度進(jìn)行回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，推出回歸方程。

2.2.2 樹上蝦丙酮提取物總黃酮含量測(cè)定

將蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液換為固定濃度提取物溶液，同上操作測(cè)定吸光度，多次測(cè)量求平均值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮的蘆丁當(dāng)量，總黃酮含量以每克干物質(zhì)的蘆丁當(dāng)量(mg)表示，并計(jì)算提取得率。

2.3 二苯基苦味肼基自由基(DPPH)體系[4]

取不同濃度樹上蝦丙酮提取物提取物溶液(0.2、0.5、0.8、1.2、1.5、1.8和2.0 mg/mL)加入8 mL DPPH(0.004%)溶液中。在最大波長(zhǎng)處(517 nm)測(cè)吸光度，直到平衡為止。清除率計(jì)算公式如下：S %=(1-A樣品)/A空白×100%。其中，A空白為未加藥液的DPPH溶液的吸光度，A樣品為加入藥液的DPPH溶液的吸光度。

2.4 羥自由基體系

以蒸餾水將75 mmo1/L鄰二氮菲無水乙醇溶液稀釋至7.5 mmol/L，依次往50 mL比色管中加入1.0 mL濃度7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液，5 mL pH值7.4 PBS，1.0 mL FeSO4溶液，一定量的抗氧劑溶液，1.0 mL H2O2應(yīng)用液，以蒸餾水補(bǔ)充體積至25 mL。37 ℃保溫反應(yīng)60 min，測(cè)A510。既加抗氧劑，又加H2O2的為加藥管;不加抗氧劑，只加H2O2的為損傷管;未損傷管兩者均不加。羥自由基清除率s= [A加藥-A損傷)]/[A未損傷-A損傷] 100%。若為負(fù)值，則表示此時(shí)表現(xiàn)促氧化性；若為正值，則表示此時(shí)表現(xiàn)抗氧化性。

3 結(jié)果

3.1 樹上蝦丙酮提取物總黃酮含量測(cè)定結(jié)果

以吸收度對(duì)溶液濃度進(jìn)行回歸分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為：y=9.6778x+0.0167(R =0.9992)。樹上蝦丙酮提取物的總黃酮含量根據(jù)線性方程計(jì)算得到，其總黃酮含量為31.2 mg/g。

3.2 樹上蝦丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

3.2.1 不同濃度提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

為了評(píng)估樹上蝦對(duì)自由基的清除能力，本論文測(cè)定了不同濃度樹上蝦丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力，如圖1。在較低藥液濃度下，樹上蝦表現(xiàn)出一定的DPPH自由基清除能力，藥液濃度為0.2 mg/mL時(shí)，提取物對(duì)DPPH自由基的清除率就達(dá)到了30.9%。藥液濃度為0.5～0.8 mg/mL時(shí)，提取物對(duì)DPPH自由基的清除率超過50%，處于54.3%～68.9%的范圍。藥液濃度為1.2和1.5 mg/mL時(shí)，提取物的DPPH自由基清除率為71.5%和76.7%，分別為藥液濃度0.2 mg/mL時(shí)數(shù)值的2.31和2.48倍。藥液濃度為1.8 mg/mL時(shí)，提取物的DPPH自由基清除率達(dá)到了84.9%。

圖1 不同濃度樹上蝦丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

3.2.2 不同時(shí)間提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖2 不同時(shí)間樹上蝦丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力(濃度=2.0 mg/mL)

樹上蝦丙酮提取物在不同作用時(shí)間對(duì)DPPH自由基的清除率如圖2所示?？梢姡趯渖衔r丙酮提取物加入時(shí)，提取物即表現(xiàn)出60.5%的清除率，說明該提取物與DPPH自由基的作用非常迅速。在作用時(shí)間為10 min時(shí)，樹上蝦丙酮提取物的DPPH自由基清除率為74.9%，為初始清除率的1.24倍。在作用時(shí)間為10 min后，樹上蝦丙酮提取物的DPPH自由基清除率增長(zhǎng)較為緩慢，作用時(shí)間70 min時(shí)，樹上蝦丙酮提取物的DPPH自由基清除率為76.7%。

3.3 樹上蝦丙酮提取物對(duì)羥基自由基的清除能力

圖3表示的是樹上蝦丙酮提取物對(duì)羥基自由基的清除能力。藥液濃度為0.2 mg/mL時(shí)，樹上蝦丙酮提取物對(duì)羥基自由基的清除率為負(fù)值，表明該濃度的藥液對(duì)羥自由基表現(xiàn)出促氧化性。藥液濃度為0.5 mg/mL時(shí)，樹上蝦丙酮提取物的羥自由基清除率為正值，表明該濃度的藥液對(duì)羥自由基表現(xiàn)出抗氧化性。濃度為0.8 mg/mL時(shí)，提取物的羥自由基清除率迅速增加為36.2。濃度為1.2和1.5 mg/mL時(shí)，樹上蝦丙酮提取物的羥自由基清除率分別達(dá)到了78.5%和85.5%。隨著藥液濃度繼續(xù)增加，樹上蝦丙酮提取物的羥自由基清除率超過了100%。

圖3 樹上蝦丙酮提取物對(duì)羥基自由基的清除能力

3.4 樹上蝦丙酮提取物對(duì)DPPH和羥基自由基的EC50值

通過不同濃度的樹上蝦丙酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除率，得到該提取物對(duì)DPPH自由基的EC50值為0.43 mg/mL。同理得出樹上蝦丙酮提取物對(duì)羥自由基的EC50值為1.06 mg/mL。該提取物對(duì)自由基具有良好的清除能力，可能與其黃酮類物質(zhì)有關(guān)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過冷浸的方式得到樹上蝦丙酮提取物，并測(cè)定其總黃酮含量。采用DPPH體系研究該提取物對(duì)自由基的清除能力。研究結(jié)果表明，樹上蝦丙酮提取物的DPPH自由基清除能力與藥液濃度有關(guān)，藥液濃度為0.2 mg/mL時(shí)，提取物對(duì)DPPH自由基的清除率就達(dá)到了30.9%。隨著藥液濃度增加，提取物對(duì)DPPH自由基的清除率增大，提取物的DPPH自由基清除率最高達(dá)到了84.9%。同時(shí)，樹上蝦丙酮提取物的DPPH自由基清除能力與作用時(shí)間有關(guān)，且提取物與DPPH自由基的作用非常迅速。此外，本實(shí)驗(yàn)研究了樹上蝦丙酮提取物對(duì)羥自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)其對(duì)羥自由基表現(xiàn)出很好的清除能力。