茶多酚冷浸提、熱提對(duì)比分析及純度測(cè)定

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(安康學(xué)院 秦巴中藥資源研發(fā)中心，陜西 安康 725000)

茶多酚是茶葉中具有強(qiáng)抗氧化作用的多酚類(lèi)物質(zhì)的總稱(chēng)，是茶葉活性成分的重要組成部分，約占茶葉干重的15%～25%，具有抗氧化、抗衰老、抗輻射、抑菌等作用，在食品、保健品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-2]，市場(chǎng)需求量逐年增加，雖然目前茶多酚的提取純化等工藝研究報(bào)道較多[3-5]，但是以低成本、易操作、高純度為原則的茶多酚提取純化工藝的研究是市場(chǎng)發(fā)展的持續(xù)關(guān)注點(diǎn)，仍然具有研究的意義。

茶多酚具有較強(qiáng)的極性，可溶于水和高濃度乙醇，其提取工藝主要是在50℃以上，以蒸餾水或60%～70%的乙醇為溶劑為溶劑[6]，采用超聲輔助法[7-9]、微波輔助法[10-11]等方法，對(duì)設(shè)備要求高，本文采用高濃度乙醇(80%)滲漏提取的冷提取法，從茶葉中提取茶多酚，提取方法簡(jiǎn)單，設(shè)備裝置簡(jiǎn)單，所得提取液，采用二級(jí)萃取分離[12-13]和二級(jí)柱分離[13-14]相結(jié)合的方法純化，得到的高純度的茶多酚的粉末。同時(shí)，采用直接加熱水提的方法做對(duì)比實(shí)驗(yàn)，從茶葉中提取茶多酚，采用同樣的純化方法，對(duì)比冷提和熱提的提取液及純化后茶多酚的純度的差異，為茶多酚的工業(yè)化生產(chǎn)降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品純度提高數(shù)據(jù)支持，同時(shí)茶多酚的冷提純化過(guò)程還可得到少量脂溶性色素作為副產(chǎn)品。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

超聲波清洗器KH2200E(超聲頻率40kHz,超聲功率80W，加熱功率600W)昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，RE-52AA，上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司，傅立葉紅外光譜儀FT-IR200美國(guó)Nicolet公司，雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，SP-1900，上海光譜儀器有限公司，高效液相色譜SPD-10AVP 日本島津，玻璃器包括：滲漏器、分液漏斗等。

茶葉為陜西省安康市本地紫陽(yáng)富硒茶，茶多酚標(biāo)品購(gòu)自北京索來(lái)寶生物科技有限公司；二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、溴化鉀、甲醇均為分析純，購(gòu)自天津市百世化工有限公司，聚酰胺(200-400目)、AB-8大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 茶多酚的冷浸提取及純化

取低溫烘干后的茶葉10.0 g，粗粉碎(過(guò)60目篩)，以料液比為1∶15加入80% 的乙醇溶液150 mL于滲漏器中，浸泡24 h后，收集初漏液125 mL，再添加80% 的乙醇溶液，滲漏速度2 mL/min，收集續(xù)漏液50 mL左右，合并兩次滲漏液，并定容至200 mL(用做冷提液樣品，采用高效液相法測(cè)定其中茶多酚含量，見(jiàn)本文結(jié)果與討論部分)。

滲漏液在0.08MPa、50 ℃減壓濃縮，回收乙醇，等體積加入二氯甲烷萃取，下層無(wú)色液體即萃余相，可從其中得到副產(chǎn)物咖啡因(詳細(xì)見(jiàn)副產(chǎn)物分離純化)，上層抹茶色萃取相再用等體積乙酸乙酯萃取兩次，上層乙酸乙酯層為淺墨綠色，減壓濃縮，0.08MPa、45 ℃下回收乙酸乙酯，濃縮液中含有目標(biāo)產(chǎn)物茶多酚和脂溶性色素。

用膠頭滴管每次吸取少量上述濃縮液，逐滴滴加上聚酰胺樹(shù)脂柱，柱內(nèi)保留時(shí)間為30 min，先用1.5倍柱體積的去離子水洗脫去除殘留咖啡因，再用1.5倍柱體積的85% 的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液。

將上述洗脫液用膠頭滴管每次吸取少量液體逐滴滴加上AB-8樹(shù)脂，柱內(nèi)保留時(shí)間30 min，用1.5倍柱體積的85%乙醇溶液洗脫，收集淡黃色洗脫液，0.08MPa、50 ℃減壓濃縮回收乙醇，低溫烘干，得到茶多酚結(jié)晶性粉末1.4618 g，得率14.62%，標(biāo)記為茶多酚樣品1。冷浸提后的濾渣經(jīng)干燥后稱(chēng)重為6.9125 g。

圖1 茶多酚冷提純化及副產(chǎn)物分離方框流程圖

Fig.1 Flow chart of tea polyphenol and by-product from cold extracting solution separation and purification

1.2.2 茶多酚的熱提取及純化

稱(chēng)取10.0 g低溫烘干后的茶葉，粗粉碎(過(guò)60目篩)，加入250 mL的蒸餾水，80 ℃提取60 min后過(guò)濾，濾渣再加入200 mL的蒸餾水80 ℃提取60 min[3]，合并兩次濾液，定容至500 mL(用做熱提液樣品采用高效液相法測(cè)定其中茶多酚含量，見(jiàn)本文結(jié)果與討論部分)。

濾液在0.08MPa、75℃下減壓濃縮，至50 mL左右，用等體積二氯甲烷萃取，取上層再用等體積乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯0.08MPa、45℃減壓濃縮，得到茶多酚的濃縮液，柱分離純化工藝過(guò)程及條件和冷浸提取后茶多酚柱分離純化方法相同,低溫烘干后得到茶多酚結(jié)晶性粉末1.0612 g，得率10.61%，標(biāo)記為茶多酚樣品2。熱浸提后的濾渣經(jīng)干燥后稱(chēng)重為5.8608 g。

圖2 茶多酚熱提純化方框流程圖

Fig.2 Flow chart of tea polyphenol from hot extraction and purification

1.3 茶多酚冷提工藝副產(chǎn)物回收及產(chǎn)量

1.3.1 咖啡因

茶多酚冷提純化過(guò)程中，二氯甲烷層中可回收副產(chǎn)物咖啡因，采取氧化鈣升華法[7]，回收得到0.0781 g白色針狀咖啡因晶體；茶多酚熱提純化過(guò)程中二氯甲烷層，回收得到0.0232 g白色針狀咖啡因晶體。

1.3.2 脂溶性色素

茶多酚冷提工藝中，利用茶葉中脂溶性色素易溶于高濃度乙醇微溶于水，不溶于二氯甲烷而易溶于乙酸乙酯的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)冷提取、萃取分離、柱分離相結(jié)合方式，從10 g茶葉中得到了副產(chǎn)物脂溶性色素0.5813 g。

1.4 茶多酚的含量/純度分析

建立高效液相色譜分析方法，對(duì)冷提、熱提的提取液和純化后的茶多酚樣品的含量/純度進(jìn)行分析。高效液相色譜條件：C18色譜柱，柱溫25 ℃，紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)279 nm，流動(dòng)相：A：甲醇；B：0.1%磷酸水溶液(A∶B = 28∶72)，流速1.0 mL/min。

標(biāo)品溶液的制備：精密稱(chēng)取茶多酚標(biāo)品粉末25.0 mg，于50 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解后，置于超聲條件下30 min，定容，以0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，濾液作為樣品儲(chǔ)備液備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定，分別取標(biāo)品儲(chǔ)備液1、2、4、6、8、10、12 mL定容至25 mL，取10μL 進(jìn)樣。

樣品溶液的制備：冷提液和熱提液，各取10 mL，以0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，濾液作為樣品供試液，取1μL 進(jìn)樣；分別精密稱(chēng)取茶多酚樣品1和茶多酚樣品2各5.0 mg，于10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶解后，定容，以0.45μm 微孔濾膜濾過(guò)，濾液作為樣品供試液，取10μL 進(jìn)樣。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶多酚標(biāo)品的高效液相色譜圖及分析

在本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相條件下，測(cè)得茶多酚標(biāo)品的高效液相色譜圖如圖3所示，共有7個(gè)峰反應(yīng)了茶多酚的主要組成(數(shù)據(jù)如表1所示)，采用保留時(shí)間定性，面積加和后進(jìn)行外標(biāo)法計(jì)算含量，茶多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到茶多酚冷提液和茶多酚熱提液中茶多酚的含量分別為2.3033 g和1.4740 g。

圖3 茶多酚標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖

Fig.3 High performance liquid chromatography of Tea polyphenol standard product

圖4 茶多酚標(biāo)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 兩種提取純化方法得到的茶多酚純度對(duì)比分析

采用高效液相法對(duì)比分析冷提純化法和熱提純化法中茶多酚的含量及純度的變化，高效液相圖譜如圖5～8所示，數(shù)據(jù)如表1、表2所示。

圖5 冷提液的高效液相色譜圖

圖6 茶多酚樣品1的HPLC圖譜

樣品序號(hào)茶多酚冷提液保留時(shí)間峰面積含量/%茶多酚樣品1保留時(shí)間峰面積含量/%12.682487614.9061.52732.698134490.2343.353723.990722312.1882.26103.99048411.1880.867534.407218940.7030.68534.39833666.8130.839746.17310439282.00032.67786.2151643287.87540.977257.9231040041.8133.25567.932323190.0008.059169.523270086.6880.84549.53288377.1092.2038714.0403194991.75010.001214.0981138515.75028.3902總和16373270.0551.25363409938.96984.6912

表2 熱提純化法的高效液相數(shù)據(jù)

圖7 熱提液的高效液相色譜圖

Fig.7 HPLC of Tea polyphenol hot extracting solution

圖8 茶多酚樣品2的HPLC圖譜

圖6和圖8對(duì)比于圖5和圖7，經(jīng)過(guò)二級(jí)萃取和二級(jí)柱分離，雜質(zhì)峰明顯減少且圖6和圖7和茶多酚標(biāo)品的HPLC圖譜在出峰的個(gè)數(shù)和位置上對(duì)應(yīng)度高；從表1和表2的數(shù)據(jù)可看到，茶多酚樣品1和茶多酚樣品2的純度分別達(dá)到了84.69%和92.02%，純度提高明顯。

3 結(jié)論

本文根據(jù)茶多酚的理化性質(zhì)，在茶多酚的提取方法上設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)單的高濃度乙醇(80%)冷浸滲漏提取的方法(冷提法)，經(jīng)HPLC法測(cè)定，得到的提取液中茶多酚含量達(dá)到了2.3033 g(占茶葉總重23.03%)，提取率高，操作方法簡(jiǎn)單、設(shè)備簡(jiǎn)單，提取液可減壓回收乙醇，溶劑循環(huán)利用，生產(chǎn)成本低，提取率和提取液的含量均高于常用的加熱提取的方法，優(yōu)勢(shì)明顯。

另外，本文采用了二級(jí)萃取和二級(jí)柱分離結(jié)合的方法進(jìn)行茶多酚提取液的純化，冷提法純化后茶多酚的得率為14.62%，純度為84.69%，熱提法純化后茶多酚的得率為10.61%，純度為92.02%。

由于冷提液的顏色是深墨綠色，和熱提的顏色區(qū)別很大，所以在冷提純化過(guò)程中，除過(guò)得到針狀咖啡因晶體外，還得到了0.5813 g脂溶性色素作為副產(chǎn)物。