黃芪甲苷抑制U937巨噬細(xì)胞CCL18表達(dá)及其作用機(jī)制研究

底雪梅，袁曜暉，張 超，高 越

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院，上海 201204；2. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 2503553;3. 海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，上海 200433)

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種慢性進(jìn)展性肺纖維化疾病。該病預(yù)后差，中位生存期3～5年[1]。其治療手段有限，有待于有效藥物的開發(fā)研制。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪為君藥的中藥復(fù)方對(duì)IPF患者有較好的臨床療效[2-3]。黃芪甲苷(AS-Ⅳ)為黃芪中的主要活性成分，最近研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷能通過抑制堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的表達(dá)，干預(yù)大鼠肺間質(zhì)纖維化進(jìn)程[4]。另有實(shí)驗(yàn)表明，黃芪甲苷抑制IPF大鼠肺纖維化與其抑制肺組織CD34的表達(dá)有關(guān)[5]。以上研究表明，黃芪甲苷確有抗肺纖維化作用，但其具體機(jī)制尚未被闡明，靶分子尚不明確。

近年來，一些與特發(fā)性肺纖維化有關(guān)的生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)，如趨化因子CCL18。研究發(fā)現(xiàn)，IPF患者血清和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中CCL18含量明顯高于健康人群[6-7]，血清和BALF中的CCL18水平與肺功能呈負(fù)相關(guān)，如一氧化碳彌散量[8]。CCL18主要由呈遞抗原細(xì)胞，如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌[9-10]。在肺纖維化形成過程中，肺泡巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是CCL18的主要來源，且在肺纖維化病理中扮演重要角色[11]。關(guān)于黃芪甲苷對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞及其CCL18分泌的作用尚未見報(bào)道，故本研究擬通過考察黃芪甲苷對(duì)CCL18表達(dá)的影響來探討其抗IPF的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI1640培養(yǎng)基、青鏈霉素溶液、疊氮碘化丙錠(PMA)、重組人白細(xì)胞介素4(rhIL-4，GIBCO公司)；胎牛血清(Biowest公司)；吡非尼酮(Shionogi公司)；STAT6抑制劑(AS1517499，Axon公司)；二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)；Cell Counting Kit-8試劑盒(Dojindo Molecular Technologies公司)；ISOGEN (Nippon Gene公司)；THUNDERBIRD Probe qPCR Mix試劑 (TOYOBO公司)；CCL18和β-actin探針(Life Technologies公司)；Cell-Based Elisa Kit試劑盒 (R&D Systems公司)；Z″-LYTETM激酶檢測試劑盒 (Life Technologies公司)；各種抗體(BioLegend公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分化

采用人單核細(xì)胞U937細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液：RPMI1640(含10%小牛血清，100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素)；細(xì)胞濃度：1×106個(gè)/ml；培養(yǎng)環(huán)境：37℃，5%CO2，95%飽和濕度。巨噬細(xì)胞分化：用10 nmol/L PMA處理U937細(xì)胞株48 h，得到U937巨噬細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞活力檢測

采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力。主要步驟如下：調(diào)整U937巨噬細(xì)胞濃度為5×103個(gè)/ml(含)，種于96孔板，加入rhIL-4(終濃度0.2 ng/ml)及不同濃度的黃芪甲苷溶液(0～800 μg/ml)，孵育72 h，每孔加入10 μg/ml CCK-8溶液，37℃，5%CO2孵育1 h，在450 nm處用酶標(biāo)儀測吸光度。

細(xì)胞活力=加藥組吸光度(A)值/對(duì)照組(A)值×100%。

1.4 Real-time PCR檢測基因表達(dá)

調(diào)整U937巨噬細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，種于6孔板，分別加入rhIL-4(終濃度0.2 ng/ml)及不同濃度的黃芪甲苷溶液(0～200 μg/ml)或20 nmol/L AS1517499，共孵育48 h，收集細(xì)胞，按照ISOGEN總RNA提取試劑盒描述的方法提取裂解細(xì)胞的總RNA。用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用THUNDERBIRD Probe qPCR Mix試劑盒和7500 FastReal Time PCR System檢測CCL18 mRNA表達(dá)，所有操作嚴(yán)格按說明書程序進(jìn)行。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。以β-actin基因表達(dá)作為內(nèi)參照物，反應(yīng)條件：95℃,50 s；再95℃,10 s，60℃,30 s，共40個(gè)循環(huán)。用比較CT值法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

表1 Real-time PCR引物序列

1.5 Elisa法測CCL18水平

調(diào)整U937巨噬細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，種于6孔板，加入rhIL-4(終濃度0.2 ng/ml)及不同濃度的黃芪甲苷溶液(0～200 μg/ml)或20 nmol/L AS1517499，共孵育48 h，收集細(xì)胞，用RIPA緩沖液裂解。用Human CCL18/PARC Quantikine Elisa Kit試劑盒測定CCL18含量，操作嚴(yán)格按說明書程序進(jìn)行。

1.6 STAT6磷酸化檢測

用Cell-Based Elisa Kit試劑盒檢測STAT6磷酸化。主要操作為：調(diào)整U937巨噬細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/ml，種于96孔板，37℃，5%CO2，孵育過夜，加入rhIL-4(終濃度0.2 ng/ml)，藥物組加入黃芪甲苷(終濃度200 μg/ml)，對(duì)照組用培養(yǎng)液補(bǔ)齊，分別孵育0、20、40、60 min。陽性對(duì)照組加入20 nmol/L AS1517499，孵育40 min。對(duì)所有細(xì)胞固定和通透，再依次與一抗(兔抗phospho-STAT6抗體和鼠抗total STAT6抗體)及二抗(HRP標(biāo)記的抗兔IgG和AP標(biāo)記的抗鼠IgG)共孵育。最后，分別加入HRP和AP的熒光探針底物，酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度。

1.7 Z″-LYTETM激酶檢測

Z″-LYTETM法是一種非細(xì)胞離體檢測，是基于熒光共軛能量轉(zhuǎn)移來檢測多肽底物磷酸化程度，從而檢測蛋白激酶的方法。本試驗(yàn)用Z″-LYTETM檢測黃芪甲苷對(duì)Janus激酶(JAK)家族JAK1、JAK2、JAK3、TYK2的抑制活性，對(duì)每種激酶的抑制率按照操作說明以百分比表示。

1.8 參與CCL18表達(dá)的STAT6檢測

IL-4與IL-4R結(jié)合可導(dǎo)致STAT6磷酸化而激活，為檢測STAT6磷酸化是否參與CCL18，采用STAT6選擇性抑制劑AS1517499，檢測其對(duì)U937巨噬細(xì)胞CCL18表達(dá)的影響。

1.9 流式細(xì)胞儀檢測IL-4R

調(diào)整U937巨噬細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，種于6孔板，加入rhIL-4 0.2 ng/ml，除對(duì)照組外，加入黃芪甲苷(終濃度200 μg/ml)，孵育48 h。收集細(xì)胞，再加入Human BD Fc Block以阻斷抗體與Fc受體的非特異性組合。然后分別加入PE和APC標(biāo)記的抗體共孵育，使抗體分別與表面IL-4受體亞基IL-4Rα,common γ chain和IL-13Rα1相結(jié)合，所加抗體分別為：PE-抗-CD124 (IL-4Rα)、APC-抗-CD132 (common γ chain)、PE-抗-CD213 (IL-13Rα1)以及同型對(duì)照抗體。用流式細(xì)胞儀檢測各亞基表達(dá)，F(xiàn)lowjo軟件分析檢測結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件完成，多組比較用one-way ANOVA分析，組間兩兩比較用Dunnett′s法或Tukey′s HSD法，以P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對(duì)細(xì)胞活力的影響

本研究采用CCK-8法考察黃芪甲苷的細(xì)胞毒作用。與對(duì)照組相比，400和800 μg/ml濃度的黃芪甲苷可以顯著抑制U937巨噬細(xì)胞的細(xì)胞活力，細(xì)胞相對(duì)活力分別為60.8%(P<0.01)和25.7%(P<0.01)，而0～200 μg/ml濃度組間比較，無顯著性差異(圖1)。因此，后續(xù)試驗(yàn)采用200 μg/ml及以下濃度進(jìn)行。

圖1 黃芪甲苷對(duì)U937巨噬細(xì)胞活力的影響 **P<0.01，與對(duì)照組即黃芪甲苷0 μg/ml濃度組比較

2.2 黃芪甲苷對(duì)U937巨噬細(xì)胞CCL18 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

U937巨噬細(xì)胞本身表達(dá)低水平的CCL18，而Th2細(xì)胞因子如IL-4可刺激巨噬細(xì)胞M2型極化，從而上調(diào)CCL18的表達(dá)。故本試驗(yàn)采用M2極化型U937巨噬細(xì)胞考察黃芪甲苷對(duì)CCL18表達(dá)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，rhIL-4刺激后，CCL18 mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)，而黃芪甲苷能顯著抑制其上調(diào)，且呈明顯的量效依賴性(圖2)。

圖2 黃芪甲苷不同濃度對(duì)U937巨噬細(xì)胞CCL18 mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)的影響 *P<0.05，與對(duì)照組比較；#P<0.05，與IL-4組比較

2.3 黃芪甲苷對(duì)IL-4R表達(dá)的影響

上述試驗(yàn)結(jié)果提示黃芪甲苷可能通過影響IL-4R或其下游途徑因子的表達(dá)而抑制U937巨噬細(xì)胞CCL18表達(dá)。因此，本試驗(yàn)采用流式細(xì)胞儀考察黃芪甲苷對(duì)U937巨噬細(xì)胞表面IL-4Rα,common γ chain和IL-13Rα1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示黃芪甲苷對(duì)這些IL-4R組成亞基表達(dá)影響不顯著(圖3)。

2.4 STAT6對(duì)CCL18表達(dá)的影響

IL-4與IL-4R相結(jié)合可導(dǎo)致磷酸化STAT6而使其激活，因此本試驗(yàn)考察STAT6激活是否參與CCL18表達(dá)，采用STAT6的選擇性抑制劑AS1517499來考察其對(duì)U937巨噬細(xì)胞CCL18表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，AS1517499可顯著抑制CCL18 mRNA和蛋白表達(dá)，表明IL-4通過STAT6激活途徑來促進(jìn)U937巨噬細(xì)胞CCL18表達(dá)(圖4)。因此，課題組又考察了黃芪甲苷對(duì)STAT6磷酸化的影響，結(jié)果顯示，IL-4刺激可顯著促進(jìn)STAT6磷酸化，而用黃芪甲苷處理40 min可抑制該誘導(dǎo)作用，但AS1517499的抑制作用比黃芪甲苷更強(qiáng)(圖5)。

圖3 黃芪甲苷對(duì)IL-4R各亞基IL-4Rα、common γ chain、IL-13Rα1表達(dá)的影響 A.IL-4Rα;B.common γ chain;C.IL-13Rα1

圖4 AS1517499對(duì)CCL18 mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)的影響 *P<0.05，與對(duì)照組比較；#P<0.05，與IL-4組比較

圖5 黃芪甲苷對(duì)STAT6磷酸化的影響 *P<0.05，與40 minIL-4組比較；#P<0.05，分別與對(duì)照組、黃芪甲苷組、IL-4組、AS1517499組比較注：“—”表示未加入黃芪甲苷，“+”表示加入黃芪甲苷

2.5 黃芪甲苷對(duì)JAK激酶作用的影響

JAK家族如JAK1、JAK2、JAK3及TYK2在IL-4與IL-4R結(jié)合后參與STAT6磷酸化過程。Z″-LYTETM激酶檢測試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪甲苷可顯著抑制JAK1、JAK3、TYK2激酶的活性，且呈明顯的量效依賴關(guān)系，而黃芪甲苷對(duì)JAK2激酶影響不明顯(圖6)，提示黃芪甲苷是通過抑制JAK1、JAK3、TYK2激酶的活性來抑制STAT6磷酸化。

3 討論

既往研究表明，IPF患者肺泡巨噬細(xì)胞選擇性激活，生物標(biāo)志物CD206和CCL18的表達(dá)上調(diào)[11]。巨噬細(xì)胞的選擇性激活，主要由Th2細(xì)胞因子，如IL-4、IL-13誘導(dǎo)[12]。而IPF患者肺組織的細(xì)胞因子環(huán)境為Th2細(xì)胞因子主導(dǎo)[13-14]，因此，Th2細(xì)胞因子可能涉及IPF的病理過程。CCL18對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞和未成熟的樹突狀細(xì)胞具有趨化活性以及促纖維化活性[15]。離體試驗(yàn)表明，CCL18可刺激肺成纖維細(xì)胞的膠原生成[16]。在體試驗(yàn)表明，大鼠肺組織CCL18的過表達(dá)導(dǎo)致T細(xì)胞浸潤和膠原沉著[17]。臨床試驗(yàn)表明，血清CCL18的表達(dá)與患者肺功能和生存率呈相關(guān)性[6]。因此，CCL18被認(rèn)為是肺纖維化的重要因子。

圖6 黃芪甲苷對(duì)JAK激酶活性的影響 A.對(duì)JAK1的抑制率；B.對(duì)JAK2的抑制率；C.對(duì)JAK3的抑制率；D.對(duì)TYK2的抑制率*P<0.05，與對(duì)照組即黃芪甲苷0 μg/ml濃度組比較

課題組采用IL-4刺激U937巨噬細(xì)胞發(fā)生M2型極化，來考察黃芪甲苷對(duì)其CCL18表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能顯著抑制CCL18 mRNA和蛋白的表達(dá)水平，且呈明顯的量效依賴性。為進(jìn)一步考察其作用機(jī)制，考察了其對(duì)IL-4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的影響。首先，考察黃芪甲苷是否導(dǎo)致細(xì)胞IL-4受體IL-4R表達(dá)下調(diào)。IL-4R分為Ⅰ型受體和Ⅱ型受體，Ⅰ型IL-4受體由IL-4Rα鏈與γc(common α)鏈組成，而Ⅱ型IL-4受體由IL-4Rα鏈與IL-13Rα1鏈組成[18]。流式細(xì)胞儀分析顯示，黃芪甲苷對(duì)IL-4受體亞基IL-4Rα(CD124),common γ chain (CD132)和IL-13Rα1(CD213)的表達(dá)無顯著影響，提示黃芪甲苷不會(huì)引起IL-4受體下調(diào)。

隨后，課題組考察黃芪甲苷對(duì)與CCL18表達(dá)相關(guān)的IL-4受體下游信號(hào)因子STAT6的影響。首先，考察STAT6磷酸化抑制劑AS1517499對(duì)CCL18表達(dá)的影響，結(jié)果表明AS1517499顯著抑制CCL18 mRNA及蛋白表達(dá)，其抑制水平達(dá)到未受IL-4刺激的狀態(tài)，證明IL-4引起的CCL18表達(dá)是通過STAT6介導(dǎo)，磷酸化后的STAT6形成二聚體轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核而引起轉(zhuǎn)錄。STAT6磷酸化試驗(yàn)結(jié)果表明黃芪甲苷能抑制STAT6磷酸化，盡管抑制作用較AS1517499輕。因此，推測黃芪甲苷對(duì)CCL18表達(dá)的抑制作用在一定程度上是通過抑制STAT6磷酸化完成的。隨之進(jìn)一步探討了黃芪甲苷抑制STAT6磷酸化的作用機(jī)制。IL-4 與其受體IL-4R結(jié)合激活STAT6磷酸化是通過JAK激酶完成。Z″-LYTETM激酶檢測結(jié)果表明，黃芪甲苷能顯著抑制JAK1、JAK3、TYK2激酶的活性，且呈量效依賴關(guān)系。

總之，黃芪甲苷可抑制IL-4引起的U937巨噬細(xì)胞CCL18的表達(dá)。其作用機(jī)制可能是通過抑制JAK激酶活性，引起STAT6的轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)，從而抑制CCL18基因表達(dá)。然而，由于黃芪甲苷對(duì)STAT6磷酸化的抑制作用有限，因此推測只是其抑制CCL18表達(dá)的途徑之一，是否還通過其他途徑尚需要進(jìn)一步的探討。