S-亞胺還原酶和葡萄糖脫氫酶共表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及手性胺的合成

李驥璇 余磊 李京美 鄭桂蘭 王洪鐘

（清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084）

手性胺及其衍生物是單一對映體藥物的重要分支，是眾多醫(yī)藥中間體及農(nóng)用化學(xué)品的結(jié)構(gòu)單元［1］，目前有超過70%的藥物都是手性胺及其衍生物，包括神經(jīng)類、抗高血壓及心腦血管等藥物［2］。手性胺的不對稱合成方法主要包括化學(xué)法合成或生物酶催化法合成，使用化學(xué)法合成手性胺合成步驟繁多，條件苛刻，污染嚴(yán)重，在實(shí)際大規(guī)模生產(chǎn)中有諸多限制［3-4］。因此，探索更加綠色高效的生物酶催化法顯得尤為重要。

手性胺的生物酶催化法常用的酶主要包括轉(zhuǎn)氨酶［5］、單胺氧化酶［6］、脫氫酶［7］和亞胺還原酶［8］等。相比其他幾種酶，亞胺還原酶具有催化合成手性仲胺和叔胺的獨(dú)特優(yōu)勢［9］，近幾年來逐漸成為生物催化合成手性胺的研究熱點(diǎn)。

亞胺還原酶主要來源于鏈霉菌屬、芽孢桿菌屬、類芽孢桿菌屬等微生物，催化S或R構(gòu)型的手性胺的合成，其中S型亞胺還原酶相較R型來說底物識別范圍更廣［1］，來源于蠟狀芽孢桿菌的亞胺還原酶就是一種S型亞胺還原酶。Man等［10］通過底物特異性的研究發(fā)現(xiàn)這種來源的酶能催化多種亞胺還原成手性胺，相比Mitsukura等［11］發(fā)現(xiàn)的鏈霉菌中的S-亞胺還原酶來說在相同反應(yīng)條件下活性更高。然而，由于亞胺還原酶是一類依賴于輔酶NADPH的氧化還原酶，該酶催化前手性的亞胺不對稱合成手性胺的過程中需要消耗等量的輔酶NADPH［12］，而輔酶NADPH價(jià)格昂貴且穩(wěn)定性低，極大地提高了手性合成胺的成本。

本研究以來源于蠟狀芽孢桿菌的亞胺還原酶和來源于枯草芽孢桿菌的葡萄糖脫氫酶為模板，利用無縫克隆的手段在pET28a質(zhì)粒中引入第二個(gè)T7啟動子和rbs序列，首次構(gòu)建了S-亞胺還原酶和葡萄糖脫氫酶的單質(zhì)粒雙啟動子共表達(dá)系統(tǒng)，并以大腸桿菌為表達(dá)宿主實(shí)現(xiàn)了輔酶NADPH的再生，以全細(xì)胞為催化劑催化手性仲胺的合成。由于很多亞胺在水溶液中不穩(wěn)定，因此，本研究選取了pH中性條件下在水溶液中幾乎不會水解的亞胺2-甲基吡咯啉（2MPN）為模式底物，檢驗(yàn)雙酶共表達(dá)的全細(xì)胞催化劑的反應(yīng)效率。同時(shí)，本研究探究了溫度、pH及有機(jī)溶劑對胞內(nèi)雙酶反應(yīng)的影響，進(jìn)一步優(yōu)化了全細(xì)胞雙酶反應(yīng)的條件，旨為亞胺還原酶高效合成手性胺奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 實(shí)驗(yàn)所用菌株E.coliDH5α 和Bl21（DE3）以及質(zhì)粒pET28a為本實(shí)驗(yàn)室保藏，重組質(zhì)粒pET28a-IRED及pET28a-GDH為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基包括0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%氯化鈉和1.5%瓊脂（固體培養(yǎng)基添加），于121℃滅菌15 min，添加卡那霉素至終濃度100 mg/ml。

1.1.3 主要試劑 Taq DNA Polymerase購于Takara公司，Exnase購于Vazyme公司，DpnⅠ酶購于Thermo Fisher Scientific公司，PCR 產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和DNA trans2K PlusMarker 購于TransGen公司，NADP+購于北京賽譜銳思公司，GITC、2-MPN和S-2MP購于上海笛柏生物公司，引物合成和測序由北京睿博興科公司完成。

1.1.4 主要儀器 PCR 儀和SDS-PAGE 蛋白電泳系統(tǒng)購于美國Bio-rad 公司，高效液相色譜儀Waters 600購于美國Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 共表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-IRED-GDH的構(gòu)建利用無縫克隆的技術(shù)將質(zhì)粒pET28a-GDH中酶切位點(diǎn)BglⅡ至gdh片段克隆至質(zhì)粒pET28a-IRED中，構(gòu)建共表達(dá)重組質(zhì)粒pET28a-IRED-GDH，使得共表達(dá)基因具有獨(dú)立的T7啟動子和rbs序列。以質(zhì)粒pET28a-IRED和質(zhì)粒pET28a-GDH為模板，分別以28a-IRED-F/R和GDH-F/R為引物，PCR擴(kuò)增制備線性化克隆載體pET28a-IRED和插入片段，使用DpnⅠ酶降解PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的環(huán)狀質(zhì)粒模板，PCR產(chǎn)物膠回收后，配制重組反應(yīng)體系，37℃反應(yīng)30 min，重組反應(yīng)后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，涂布到卡那抗性平板并通過菌液PCR驗(yàn)證陽性克隆，送至公司測序。菌液PCR所用引物為IRED-GDHF/R。將測序驗(yàn)證結(jié)果正確的陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)宿主Bl21（DE3）中，構(gòu)建重組共表達(dá)菌Bl21（DE3）/ pET28a-IRED-GDH。

表1 本實(shí)驗(yàn)中的引物序列

圖1 亞胺還原酶-葡萄糖脫氫酶共表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建圖

1.2.2 重組共表達(dá)菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活測定 將構(gòu)建好的共表達(dá)重組菌株Bl21（DE3）/ pET28a-IRED-GDH接種于100 mL卡那抗性的LB培養(yǎng)基中，37℃、200 rpm恒溫?fù)u菌3 h，至OD600值約為0.8時(shí)加入0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，于20℃誘導(dǎo)過夜。誘導(dǎo)21 h后收集菌體，磷酸緩沖液洗滌菌體后重懸菌體，冰浴超聲破碎15 min，離心后取上清用于SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)和酶活測定。亞胺還原酶和葡萄糖脫氫酶的酶活測定方法參考文獻(xiàn)［1，13］。酶活力單位U定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘還原（氧化）1 μmol NADPH（NADP+）的酶量。

1.2.3 重組菌全細(xì)胞催化制備手性胺 以重組共表達(dá)菌株為全細(xì)胞催化劑，催化亞胺2-甲基吡咯啉（2MPN）合成（S）-2-甲基吡咯烷（（S）-2MP）。活性測定的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系包括5 mmol/L 2MPN、50 mmol/L D-葡萄糖、0.5 mmol/L NADP+、適量有機(jī)溶劑甲醇，以10 g/L重組菌株作為催化劑，反應(yīng)在30℃、pH 7.5的磷酸緩沖液中進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后用二氯甲烷萃取產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)以菌株Bl21（DE3）/pET28a為空白對照。

圖2 雙酶反應(yīng)合成手性胺示意圖

1.2.4 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率和純度檢測 HPLC檢測產(chǎn)物（S）-2MP的生成參考文獻(xiàn)［1］的方法。以2，3，4，6-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖基異硫氰酸酯（GITC）為柱前衍生化試劑，取50 μL反應(yīng)后的溶液，與100 μL 0.8%（W/V）的 GITC（溶于乙腈）和 50 μL 0.2%（V/V）的三乙胺（溶于乙腈）混合，40℃反應(yīng)1 h后用HPLC檢測產(chǎn)物生成情況。采用色譜柱為普通C18反向色譜柱，流動相為甲醇∶水=1∶1，流速為1 mL/min，檢測波長為254 nm。柱前衍生化后HPLC可將2-甲基吡咯烷的對映體分開，利用HPLC圖譜中產(chǎn)物峰面積和濃度成正比的關(guān)系可繪制產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線和實(shí)際反應(yīng)后的產(chǎn)物峰面積，可計(jì)算產(chǎn)物濃度，從而計(jì)算反應(yīng)轉(zhuǎn)化率=實(shí)際反應(yīng)產(chǎn)物峰面積/理論完全反應(yīng)產(chǎn)物峰面積*100%［11］。

1.2.5 溫度、pH和有機(jī)溶劑對雙酶反應(yīng)的影響 設(shè)置10-50℃的溫度梯度，初始pH 7.5，添加5 mmol/L 2MPN、50 mmol/L D-葡萄糖、0.5 mmol/L NADP+和適量甲醇，反應(yīng)24 h；設(shè)置pH 5-11的pH梯度，添 加 5 mmol/L 2MPN、50 mmol/L D-葡 萄 糖、0.5 mmol/L NADP+和適量甲醇，30℃反應(yīng)24 h；設(shè)置0-40%的有機(jī)溶劑甲醇濃度梯度，初始pH 8，添加5 mmol/L 2MPN、50 mmol/L D-葡萄糖、0.5 mmol/L NADP+，30℃反應(yīng)24 h。通過測定反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率，研究溫度、pH和有機(jī)溶劑濃度對全細(xì)胞雙酶反應(yīng)的影響。在最優(yōu)反應(yīng)條件下測定高底物濃度條件下全細(xì)胞雙酶反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率。

2 結(jié)果

2.1 重組共表達(dá)菌株Bl21（DE3）/pET28a-IREDGDH的構(gòu)建

以pET28a-GDH為模板，以GDH-F/R為引物，PCR擴(kuò)增出重組質(zhì)粒中酶切位點(diǎn)BglⅡ至gdh片段，目的片段約1 000 bp；以pET28a-IRED為模板，以28a-IRED-F/R為引物，PCR擴(kuò)增出線性化克隆載體，線性化載體片段約6 300 bp（圖3-A）。DpnⅠ酶降解PCR產(chǎn)物中的環(huán)狀質(zhì)粒模板，膠回收后的目的片段和線性化克隆載體在重組酶的作用下發(fā)生同源重組反應(yīng)，反應(yīng)后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，利用菌液PCR的方法篩選陽性克隆，菌液PCR結(jié)果如圖3-B所示，IRED-GDH片段約2 000 bp大小。PCR鑒定成功的陽性克隆送至公司測序，經(jīng)測序序列與已知序列一致。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)宿主Bl21（DE3）中，成功構(gòu)建重組共表達(dá)菌株Bl21（DE3）/ pET28a-IRED-GDH。

圖3 T7-GDH片段和線性化克隆載體的PCR擴(kuò)增及陽性克隆鑒定

2.2 重組共表達(dá)菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及酶活測定

重組共表達(dá)菌株Bl21（DE3）/ pET28a-IREDGDH經(jīng)過誘導(dǎo)后收集菌體，以12%的SDS-PAGE檢測蛋白表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果如圖4所示，重組菌株在35 kD和38 kD的位置有明顯的蛋白表達(dá)。本研究使用的亞胺還原酶的理論蛋白大小約為35 kD，由于其N端帶有his tag和T7 tag大約為3 kD，故表達(dá)的重組亞胺還原酶約為38 kD。本研究中的葡萄糖脫氫酶理論蛋白大小約為29 kD，但由于其N端帶有his tag和T7 tag，C端也帶有his tag，標(biāo)簽蛋白大小約為6 kD，故表達(dá)的蛋白大小約為35 kD。SDSPAGE電泳圖的目的條帶位置與兩種蛋白的預(yù)測大小一致。酶活測定結(jié)果顯示IRED和GDH的酶活分別為68 U/g和58 U/g。

圖4 重組共表達(dá)菌株的SDS-PAGE檢測

2.3 重組菌全細(xì)胞催化制備手性胺

以重組共表達(dá)菌株Bl21（DE3）/ pET28a-IREDGDH為催化劑，以氧化型輔酶NADP+為輔酶供體，催化5 mmol/L 2MPN的不對稱還原反應(yīng)，反應(yīng)后溶液經(jīng)柱前衍生化后以HPLC檢測手性仲胺S-2MP的產(chǎn)率和光學(xué)純度，結(jié)果如圖5所示。通過對比空質(zhì)粒對照菌株反應(yīng)液柱前衍生化后的HPLC檢測圖，可看出反應(yīng)后生成了手性胺S-2MP，光學(xué)純度＞95%。

2.4 溫度和pH對雙酶反應(yīng)的影響

溫度和pH對酶活有極大的影響，不同的酶在作為生物催化劑時(shí)都有不同的最適溫度和pH，但當(dāng)雙酶偶聯(lián)同時(shí)催化反應(yīng)時(shí)，需要綜合考慮溫度和pH對兩種酶的酶活的影響。本研究分別考察了溫度和pH對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖6所示。反應(yīng)結(jié)果表明，在30-37℃之間，IRED和GDH的活性都較強(qiáng)，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較高；雙酶反應(yīng)在弱堿性條件下轉(zhuǎn)化率更高，在pH 8時(shí)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高。

2.5 有機(jī)溶劑甲醇濃度對雙酶反應(yīng)的影響

圖5 重組共表達(dá)菌株生物催化反應(yīng)HPLC圖譜

圖6 溫度和pH對全細(xì)胞雙酶反應(yīng)的影響

IRED可催化亞胺還原為手性胺，而很多亞胺和手性胺不溶于水，故在反應(yīng)體系中添加適量的有機(jī)溶劑對于底物助溶和提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率有重要意義。本研究考察了不同甲醇濃度對雙酶反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果表明，利用全細(xì)胞進(jìn)行雙酶偶聯(lián)反應(yīng)時(shí)，適量的甲醇對反應(yīng)有促進(jìn)作用，當(dāng)添加的甲醇濃度為10%時(shí)對反應(yīng)速率的促進(jìn)作用最大，甲醇濃度大于10%時(shí)會抑制雙酶反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較低。

圖7 甲醇濃度對雙酶反應(yīng)的影響

2.6 最優(yōu)反應(yīng)條件下雙酶反應(yīng)的效率

在最優(yōu)反應(yīng)條件下，添加低濃度輔酶，重組共表達(dá)菌株催化手性胺S-2MP合成的轉(zhuǎn)化率及光學(xué)純度均＞95%；當(dāng)提高底物濃度至30 mmol/L，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為55.9%，光學(xué)純度為93.4%ee。

3 討論

自2010年Mitsukura等［11］篩選出5種具有手性還原亞胺活性的鏈霉菌，越來越多來源的亞胺還原酶被發(fā)現(xiàn)。目前亞胺還原酶的研究方向主要集中于新型亞胺還原酶的篩選及酶學(xué)性質(zhì)的探索［15-16］。已有的研究表明，純化后的亞胺還原酶在輔酶NADPH的參與下可以催化手性胺的合成，且與葡萄糖脫氫酶或葡萄糖-6磷酸脫氫酶聯(lián)用可以實(shí)現(xiàn)輔酶再生，有效減少輔酶在反應(yīng)中的使用量［17］。但目前報(bào)道的輔酶再生系統(tǒng)都是添加游離的純酶作為催化劑實(shí)現(xiàn)輔酶再生，關(guān)于構(gòu)建胞內(nèi)雙酶共表達(dá)偶聯(lián)體系以實(shí)現(xiàn)輔酶NADPH再生的研究仍然較少。

以游離的兩種純酶偶聯(lián)雖然也能實(shí)現(xiàn)輔酶NADPH的再生，但需要菌體破碎和酶純化等步驟，反應(yīng)后純酶與產(chǎn)物難以分離，操作繁瑣且成本高昂，相較之下利用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化則有更大的優(yōu)勢，還可以重復(fù)利用［13］。通過構(gòu)建亞胺還原酶和葡萄糖脫氫酶的雙酶共表達(dá)菌株，可以實(shí)現(xiàn)兩種酶在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，減少了雙菌雙酶反應(yīng)可能存在的雙層細(xì)胞膜屏障問題［18］。本研究利用無縫克隆的手段在pET28a中引入了第二個(gè)T7啟動子和rbs序列，使得每個(gè)基因有獨(dú)立的T7啟動子系統(tǒng)，構(gòu)建了亞胺還原酶和葡萄糖脫氫酶的單質(zhì)粒共表達(dá)系統(tǒng)。這種雙啟動子共表達(dá)系統(tǒng)相比于單啟動子共表達(dá)系統(tǒng)來說，蛋白表達(dá)量往往更高［19］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，在雙啟動子共表達(dá)系統(tǒng)的蛋白表達(dá)中，上下游基因均有明顯的蛋白表達(dá)。

本研究以S-亞胺還原酶和葡萄糖脫氫酶的共表達(dá)菌株為全細(xì)胞催化劑催化手性仲胺S-2MP的合成，與亞胺還原酶和葡萄糖-6磷酸脫氫酶的純酶聯(lián)用反應(yīng)相比［10］，減少了超聲破碎及純化蛋白的復(fù)雜步驟，且共表達(dá)菌株在低輔酶的條件下反應(yīng)轉(zhuǎn)化率和光學(xué)純度均可達(dá)到＞95%的水平，相較于Leipold等［20］利用單酶表達(dá)的重組菌催化反應(yīng)，使用的菌體量降低，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率提至1.7倍。本研究嘗試提高底物濃度至30 mmol/L，轉(zhuǎn)化率仍然＞55%，說明大腸桿菌胞內(nèi)共表達(dá)體系的構(gòu)建有效解決了其胞內(nèi)輔酶NADPH不足的問題，保障了不對稱轉(zhuǎn)化過程中的輔酶供給。同時(shí)，本研究以葡萄糖為輔酶再生底物，相較于葡萄糖-6磷酸，底物價(jià)格更為低廉，有效降低了反應(yīng)成本。但提高底物濃度后反應(yīng)轉(zhuǎn)化率下降，其原因可能是反應(yīng)過程中產(chǎn)生的大量葡萄糖酸引起了體系中pH的變化，導(dǎo)致酶活下降，這也說明利用該輔酶再生系統(tǒng)大規(guī)模制備手性胺需要嚴(yán)格控制pH的條件。

多酶共催化的最適反應(yīng)條件往往需要綜合考慮不同酶的酶活，因此本研究還探究了溫度和pH對胞內(nèi)雙酶反應(yīng)的影響。根據(jù)已有的研究報(bào)道，亞胺還原酶的最適溫度在40℃左右，最適pH往往在6.0-7.5之間［21］，該酶的最適pH就為6，但共表達(dá)菌株在催化反應(yīng)時(shí)pH的堿性耐受性更高，在pH值達(dá)到9時(shí)仍能保留較高酶活，這可能是因?yàn)榧?xì)胞膜的保護(hù)作用減少了外部環(huán)境變化對酶活的影響。通過添加不同濃度甲醇，全細(xì)胞催化的轉(zhuǎn)化率也有所不同，當(dāng)甲醇濃度低于10%時(shí)，甲醇濃度與轉(zhuǎn)化率呈正相關(guān)的關(guān)系，這有可能是因?yàn)榈蜐舛鹊募状紝Φ孜镉兄茏饔们腋淖兞思?xì)胞膜通透性，當(dāng)甲醇濃度高于10%時(shí)，高濃度的有機(jī)溶劑使得胞內(nèi)酶的酶活降低所致。

本研究通過構(gòu)建葡萄糖脫氫酶和S-亞胺還原酶的胞內(nèi)共表達(dá)體系實(shí)現(xiàn)了輔酶NADPH在胞內(nèi)的再生，以全細(xì)胞為催化劑反應(yīng)增加了酶對外部環(huán)境變化的適應(yīng)性，減少了輔酶使用量，降低了合成手性胺的成本，為手性胺的規(guī)模制備奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)我們也將嘗試?yán)迷擉w系催化合成更復(fù)雜的手性胺及其衍生物。

4 結(jié)論

本研究利用無縫克隆的手段構(gòu)建了S-亞胺還原酶和葡萄糖脫氫酶的重組共表達(dá)菌株Bl21（DE3）/pET28a-IRED-GDH，在雙啟動子的調(diào)控下上下游基因均有明顯的表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示蛋白大小與預(yù)期相符。以重組共表達(dá)菌株為全細(xì)胞催化劑催化手性仲胺的合成，輔酶NADPH使用量大大降低。通過對反應(yīng)溫度、pH和有機(jī)溶劑甲醇濃度的探索，優(yōu)化了全細(xì)胞雙酶反應(yīng)的條件為：最適反應(yīng)溫度37℃，最適反應(yīng)pH 8，最適甲醇濃度10%。