固碳微生物菌株的分離鑒定及其固碳能力測定

郭珺 樊芳芳 王立革 武愛蓮 鄭軍

（1. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所 山西省土壤環(huán)境與養(yǎng)分資源重點實驗室，太原 030031；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所，晉中 030600；3. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，臨汾 041000）

受到全球工業(yè)飛速發(fā)展及人為活動的影響，溫室氣體引起的全球變化成為學(xué)術(shù)界研究可持續(xù)發(fā)展的重點研究領(lǐng)域［1］。造成溫室效應(yīng)的主要氣體是CO2，合理固定CO2也可使無機碳轉(zhuǎn)化為巨大的可再生碳資源［2-3］，在提倡減排的同時，國內(nèi)外學(xué)者探索了化學(xué)固碳、物理固碳和生物固碳等多種固碳技術(shù)［4-10］。生物固碳是通過植物與微生物的固碳能力來實現(xiàn)的［11］，在多種固定CO2的途徑中，因其綠色經(jīng)濟且無污染等特點而備受關(guān)注［12-13］。而微生物以其環(huán)境適應(yīng)性強、生長迅速、繁殖快等優(yōu)勢，成為目前固定CO2研究的焦點。從整個生物圈的物質(zhì)流、能量流而言，微生物固定CO2在環(huán)境、能源和資源方面具有極其重要的意義［14-15］。

在國內(nèi)外的各種研究中可固定CO2的微生物主要為自養(yǎng)菌，廣泛分布在如海洋深處［15-16］、火山口［17］、湖泊盆地［18］、土壤［19-21］等多種生態(tài)環(huán)境下，從以上研究中也分離獲得了一些固碳微生物，大多為古細(xì)菌、藍細(xì)菌、光合細(xì)菌以及一些混合培養(yǎng)的菌群［15-21］，多數(shù)為兼性厭氧菌，在菌種純化、保存和應(yīng)用方面存在一定難度。因此，如何既能利用微生物繁殖快、對環(huán)境適應(yīng)性強、生長周期短的特點，又能分離和篩選到易培養(yǎng)，好保存的固碳菌株，成為本研究的目的。

本研究嘗試從自養(yǎng)微生物含量較高的活性污泥、沼液及設(shè)施土壤中分離篩選固CO2菌，并對其進行形態(tài)觀察和生理生化反應(yīng)測定和16S rDNA測序分析，通過對比進行鑒定，并對其生長情況和RubisCO酶活性進行研究，同時檢測固碳酶RubisCO中cbbL基因的特異性條帶，最后將高效固碳菌株施入土壤中，檢測其對土壤RubisCO酶活性的影響。以期通過利用固碳微生物的作用，減少空氣中CO2氣體的濃度，為減緩“溫室效應(yīng)”提供更加高效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 采集于活性污泥（太原市東太堡污水處理廠）、沼液、設(shè)施土壤等多種生態(tài)環(huán)境中，樣品采集后將其保存于保鮮袋中并帶回實驗室進行處理。

1.1.2 無碳源無機培養(yǎng)基組成成分［15，19］： （1）MnSO40.02 g、Na2HPO41 g、KH2PO41.8 g、MgSO40.4 g、CaCl20.05 g、NaCl 1 g、NH4Cl 0.5 g、FeCl30.02 g、Na2S2O310 g，蒸餾水加至1 000 mL，121℃滅菌20 min，備用。（2）MnSO41 g、Na2HPO40.5 g、KH2PO40.5 g、MgSO41g、CaCl20.2 g、NaHCO31 g、NH4Cl 0.5 g、KNO31 g、NaCl 0.4 g、微量元素溶液 2 mL，蒸餾水加至1 000 mL，121℃滅菌20 min，備用。其中，微量元素溶液的配制為：FeCl30.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.3 g，MnSO4·H2O 0.15 g，ZnSO40.14 g，CoCl20.2 g，定容至1 000 mL，過濾除菌后備用。

1.2 方法

1.2.1 固CO2菌株分離純化及篩選 將10 g樣品加入裝有 90 mL無菌水的三角瓶中充分混合，置于30℃，150 r/min搖床振蕩約20 min，制成懸液，進行梯度稀釋。在無菌操作下，選取10-5、10-6、10-7稀釋濃度，吸取1 mL 樣品懸液注入盛有無碳源固體培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)皿中，涂勻，28℃倒置培養(yǎng)7-10 d，挑取單菌落，進行標(biāo)記，劃線分離純化多次，于4℃保存［22］。篩選生長速度較快的菌株進行進一步研究。

1.2.2 固CO2菌株固碳功能基因cbbL的克隆

1.2.2.1 細(xì)菌基因組DNA的提取及固CO2菌株cbbL基因的擴增 按照Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）的提取步驟，提取不同菌株的基因組DNA。置-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。以提取的?xì)菌組總DNA為模板，進行cbbL基因的擴增［23］，擴增引物的上游引物為k2F：ACCAY CAAGC CSAAG CTSGG，下游引物為：v2F：GCCTT CSAGC TTGCC SACCRC，引物由上海生工技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系參照試劑盒（生工）采用25 μL體系：DNA 模板 1 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，2×Taq PCR Master mix 12.5 μL。PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性45 s，57℃退火45 s，72℃延伸60 s（35次循環(huán)），72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在100 V電壓下用1.0%瓊脂糖凝膠電泳30 min，經(jīng)染色后在凝膠成像儀下拍照，確定含cbbL基因的固碳菌菌株。

1.2.2.2cbbL基因測序 將492 bp 目標(biāo)條帶的25 μL體系的PCR產(chǎn)物全部進行切膠回收，按照SanPrep柱式 DNA 膠回收試劑盒（上海生工）對DNA進行回收，得到純化后的DNA條帶。PCR產(chǎn)物的連接載體用pGEM-TEasy，連接體系用10 μL體系：pGEMTEasy Vector 1 μL，PCR Products 4 μL，Ligation Mix 5 μL。連接反應(yīng)條件為4℃反應(yīng)過夜。加入50 μL competent cells，置于冰上靜置30 min后，42℃水浴90 s，冰上放置2 min。加入500 μL的LB稀釋液，輕輕搖勻。涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)，通過藍白篩選挑選出白色菌落。挑取白色單菌落于3 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃，165 r/min恒溫箱中振蕩培養(yǎng)6 h。PCR檢測陽性克隆，送測序公司測序。

1.2.3 固CO2菌株的鑒定 對分離篩選到的固CO2菌株進行菌種鑒定。

1.2.3.1 固CO2菌株形態(tài)特征 將分離篩選到的菌株進行菌落特征、生長情況的觀察，并進行革蘭氏染色，鏡檢［24］。

1.2.3.2 固CO2菌株生理生化特性 將分離篩選到的菌株進行淀粉水解、明膠水解、乳酸產(chǎn)生、甲基紅反應(yīng)、吲哚反應(yīng)等生理生化反應(yīng)，觀察記錄反應(yīng)結(jié)果［25］。

1.2.3.3 16S rDNA基因的擴增 設(shè)計16S rDNA基因序列引物［26］：上游引物 16S A5′-AGTTT GATCC TGGCT CA-3′， 下 游 引 物 16S B 5′-TACCT TGTTA CGACT TCA-3′。PCR反應(yīng)體系參照上海生工的PCR擴增試劑盒，采用25 μL體系：DNA模板1 μL，上游引物 1 μL，下游引物 1 μL，2×PCR mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 3 min；35個循環(huán)為94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸3 min；72℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物在100 V電壓下用1.0% 的瓊脂糖凝膠電泳30 min檢測擴增片段，經(jīng)染色后置于凝膠成像儀下拍照記錄。

1.2.3.4 16S rDNA基因與載體pMD20-T的連接 將單一條帶的25 μL體系的PCR產(chǎn)物全部進行切膠回收，按照SanPrep柱式 DNA 膠回收試劑盒（上海生工）對DNA進行回收，得到純化后的DNA條帶。PCR產(chǎn)物的連接載體用pMD20-T Vector System，連接體系用 10 μL 體系 ：pMD20-T Vector 1 μL，PCR Products 1 μL，Ligation Mix 5 μL，ddH2O 3 μL。連接反應(yīng)條件為16℃反應(yīng)30 min。加入50 μL competent cells，置于冰上靜置20 min后，水浴60 s，放置2 min。加入500 μL的LB稀釋液，輕輕搖勻。涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板上，37℃過夜培養(yǎng)，通過藍白篩選挑選出白色菌落［27］。

1.2.3.5 重組子的篩選 將過夜培養(yǎng)的平板拿出后，觀察菌落情況，置于4℃冰箱以便更明顯的分辨藍白菌落。挑取白色單菌落于3 mL液體LB培養(yǎng)基中，37℃，165 r/min恒溫箱中振蕩培養(yǎng)過夜。按照質(zhì)粒DNA抽提試劑盒的步驟，對菌液進行質(zhì)粒DNA的提取。在插入位點的上游和下游分別選擇一個高酶位點，對質(zhì)粒DNA進行酶切驗證。上游選擇HindⅢ，下游選擇EcoRI。

1.2.3.6 序列測定與分析 重組質(zhì)粒送上海生工進行序列測定，序列測定采用雙向測定，測序結(jié)果在GenBank 中進行 BlAST 比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［28］。

1.2.4 固碳菌菌體生長及菌體含量測定 選取分離篩選到的固碳菌菌株進行液體培養(yǎng)，通過測定菌液OD值及離心后菌體的干重，選擇生長快、菌體含量高的固碳菌菌株進行土壤培養(yǎng)試驗。

1.2.5 土壤中固碳菌培養(yǎng)試驗 在田間采集土壤，風(fēng)干，去除石塊、植株根系等雜質(zhì)后，過2 mm篩，測定土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分含量（pH 8.73，EC 610 μs/cm，全N 0.28 g/kg，有效磷 1.5 mg/kg，速效鉀 97.16 mg/kg，有機質(zhì) 3.65 g/kg），備用。采用內(nèi)徑20 cm，深度30 cm的塑料盆，每盆裝土5 kg。隨水施入固碳菌菌液，按菌液原液0.5 mL/kg土施用，每15 d補施一次菌液。定期向土壤補充水分，培養(yǎng)結(jié)束后測定土壤的RubisCO 酶活性。以不施菌液為空白處理，施用滅菌固碳菌為對照。每個處理重復(fù)5盆。

1.2.6 RubisCO酶活性測定

1.2.6.1 樣品處理 土壤樣品采集后置于液氮中帶回實驗室后-80℃超低溫冰箱保存。測定前稱取樣品1 g加9 mL勻漿液在研缽中進行勻漿，勻漿液為PBS（pH7.2-7.4，濃度為0.01 mol/L）。土壤樣本需進行含水率的測定。菌液樣品加PIPA裂解液進行處理。

1.2.6.2 RubisCO酶酶聯(lián)免疫分析測定 菌樣、植株及土壤樣品的RubisCO 酶活性利用上海生工提供的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RubisCO）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒進行測定［29］。測定方法參照試劑盒說明書，方法如下：（1）標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μL，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取100 μL分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μL，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50 μL棄掉，再各取50 μL分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μL，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50 μL分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μL，混勻后從第七、第八孔中分別取50 μL加到第九、第十孔中，再在第九、第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50 μL，混勻后從第九、第十孔中各取50 μL棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50 μL，濃度分別為150 ng/L、100 ng/L、50 ng/L、25 ng/L和 12.5 ng/L）。（2）加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。（3）溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。（4）配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。（5）洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。（6）加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外。（7）溫育：操作同3。（8）洗滌：操作同5。（9）顯色：每孔先加入顯色劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。（10）終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。（11）測定：加終止液后15 min以內(nèi)進行測定，以空白調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離篩選

利用無碳源無機培養(yǎng)基從3種樣品中分離到24株菌株，采用劃線分離純化后，對其生長情況進行觀察，篩選出生長速度較快的8株菌，分別編號為：C2-8R、CX-9R、C5-6R、C2-8W、K01R、S01W、K01W和01W-1。

2.2 cbbL基因分析

對生長速度較快的8株菌進行cbbL固碳基因的鑒定。用cbbL基因的兼并引物對細(xì)菌總DNA進行擴增，擴增結(jié)果見圖1，圖中結(jié)果顯示，C2-8R、CX-9R、C5-6R、K01R、S01W和01W-1菌株在500 bp附近出現(xiàn)cbbL基因目的片段條帶。

圖1 8株菌cbbL基因PCR擴增結(jié)果

將測序公司測序結(jié)果進行比對，8株菌可歸為兩大類，結(jié)果見圖2。

圖2 8株菌cbbL基因比對結(jié)果

2.3 固CO2菌株的鑒定

2.3.1 固CO2菌株形態(tài)特征 對篩選的生長速度較快的8株固CO2菌株進行菌落形態(tài)觀察及革蘭氏染色鏡檢。菌落形態(tài)均為黏著突起，直徑在1-5 mm之間，菌落顏色為紅色的是：C2-8R、CX-9R、C5-6R、K01R；菌落顏色為白色的是：C2-8W、S01W、K01W、01W-1；革蘭氏染色為陰性菌的是：C2-8R、CX-9R、C5-6R、C2-8W、K01R和01W-1。革蘭氏染色為陽性菌的是：S01W和K01W。

2.3.2 固CO2菌株生理生化反應(yīng) 對篩選到的生長較快的8株菌株進行生理生化反應(yīng)實驗，其淀粉水解、明膠水解、乳酸產(chǎn)生、甲基紅反應(yīng)和吲哚反應(yīng)等生理生化反應(yīng)均呈陰性。

2.4 16S rDNA序列分析結(jié)果

2.4.1 細(xì)菌基因組DNA的提取及擴增 對生長較好的8株菌株進行DNA測序分析。利用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測提取到細(xì)菌基因組DNA大小約為20 000 bp。以不同菌株基因組DNA為模板進行PCR反應(yīng)，產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，只有一條擴增帶，特異性較高。

2.4.2 重組質(zhì)粒的的分子驗證 PCR擴增產(chǎn)物與pMD20-T Vector載體重組后轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α細(xì)胞中，經(jīng)篩選后，提取3個重復(fù)菌落的質(zhì)粒DNA，進行限制性內(nèi)切酶酶切驗證（圖3）。從得到的圖中可以明顯觀察到泳道經(jīng)酶切后會出現(xiàn)新的DNA片段，可以發(fā)現(xiàn)有2個新片段出現(xiàn)，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是目的片段上具有2個限制性內(nèi)切酶位點。實驗結(jié)果表明：重組質(zhì)粒上有連接片段，16S rDNA已克隆到pMD20-T載體上，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 酶切驗證圖

2.4.3 序列測定與分析 得到的重組質(zhì)粒由上海生工公司進行序列測定，測序結(jié)果在 GenBank 中進行BlAST 比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。篩選的菌株分別聚類假單胞菌屬和嗜甲基菌屬。

2.5 固碳菌菌體生長及菌體含量測定

通過2.3，2.4結(jié)果，選取C2-8R、CX-9R、C5-6R、S01W及01W-1菌株進行液體培養(yǎng)，對菌液OD值和菌體干重進行測定，結(jié)果見圖5、圖6。從這兩個圖可以看出，C2-8R菌株的生長速度及菌體含量都優(yōu)于其他菌株。

2.6 固碳菌菌液RubisCO酶活性測定

將2.4中液體培養(yǎng)的C2-8R、CX-9R、C5-6R、S01W和01W-1菌株的菌液進行RubisCO 酶活性測定，利用上海生工提供的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RubisCO）酶聯(lián)免疫分析試劑盒進行測定，測定結(jié)果見圖7。C2-8R菌株RubisCO酶活性最高，因此，選取C2-8R菌株進行土壤施用試驗。

2.7 土壤中施固碳菌試驗結(jié)果

土壤樣品的RubisCO 酶活性利用上海生工提供的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RubisCO）酶聯(lián)免疫分析試劑盒進行測定，測定結(jié)果見圖8。由圖8可見，施入固碳菌C2-8R菌液后土壤樣品的RubisCO 酶活性均比不施用菌液和滅菌菌液的活性高，初步認(rèn)為固碳菌C2-8R菌液施入土壤后可提高土壤的RubisCO 酶活性。

3 討論

目前生物固碳主要是通過植物和微生物的循環(huán)途徑將CO2轉(zhuǎn)化為有機物質(zhì)［30］，植物是通過光合作用來固定CO2，微生物固定CO2則大多是通過自養(yǎng)微生物來實現(xiàn)的，自養(yǎng)微生物從能量獲得的途徑不同分為光能自養(yǎng)微生物和化能自養(yǎng)微生物。光能自養(yǎng)微生物主要包括微藻類和光合細(xì)菌，化能自養(yǎng)微生物包括嚴(yán)格化能自養(yǎng)菌和兼性化能自養(yǎng)菌［31］。目前固碳菌的研究在微藻和光合細(xì)菌方面涉及較多，化能自養(yǎng)微生物的研究集中在氫氧化細(xì)菌和固碳微生物菌群方面，此類自養(yǎng)微生物需要提供電子供體來進行繁殖［15，21，32］。本研究利用無碳源無機培養(yǎng)基分離篩選的固碳菌株可以直接利用CO2作為碳源生長，不需要外加碳源和電子供體，降低了固碳成本。

卡爾文（Calvin）循環(huán)是化能自養(yǎng)微生物固定CO2的主要途徑，RubisCO酶是催化自養(yǎng)微生物利用卡爾文循環(huán)進行CO2固定的限速酶，cbbL基因則是編碼RubisCO 酶的碳同化功能基因，含有cbbL基因的菌株具有編碼RubisCO酶的能力，較高的RubisCO酶活性則說明自養(yǎng)微生物具有較高的碳同化能力［33］。本研究篩選的可利用CO2生長的菌株，通過cbbL基因和RubisCO酶活性的檢測，優(yōu)選出固碳能力強的菌株。下一步將對固碳菌菌株進行馴化和發(fā)酵條件優(yōu)化，使其應(yīng)用到生產(chǎn)實踐中，吸收空氣中的CO2減輕溫室效應(yīng)，最終造福人類。

4 結(jié)論

本研究利用以空氣中CO2為唯一碳源的無碳源培養(yǎng)基，從多種生態(tài)環(huán)境中分離篩選到生長較快的固CO2菌8株，并對其進行形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和生理生化特性研究。

圖4 固碳菌假單胞菌屬和嗜甲基菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 固碳菌菌液OD值比較

圖6 固碳菌菌體含量比較

圖7 固碳菌菌液RubisCO酶活性比較

圖8 施固碳菌菌液后土壤樣品的RubisCO酶活性比較

通過16S rDNA 序列測定，對部分生長較快的菌株進行分子鑒定并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定分離純化的固碳菌的分子生物學(xué)地位，篩選的菌株分別聚類假單胞菌屬和嗜甲基菌屬。

通過對5株生長快、含cbbL基因的固CO2菌株進行生長曲線、菌體含量和RubisCO酶活性的測定，篩選確定固碳效率高的菌株C2-8R（Methanotrophs extorquens）進行應(yīng)用研究。

通過C2-8R菌液施入土壤試驗發(fā)現(xiàn)，施用C2-8R菌液的土壤中RubisCO 酶活性均比不施用菌液和滅菌菌液的活性高，初步認(rèn)為固碳菌C2-8R菌液施入土壤后可提高土壤的RubisCO 酶活性。