非小細(xì)胞肺癌中l(wèi)ncRNA DLEU1的表達(dá)對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

張杰 劉索 甘毅 金龍玉

肺癌是最常見的癌癥之一，也是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因，可分為小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），超過85%的肺癌病例屬于NSCLC［1］。近年來，盡管在治療和預(yù)后方面取得了較大進(jìn)展，但NSCLC患者的總體5年生存率仍然低于15%［2］。長片段非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）通常是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，且無明顯的蛋白質(zhì)編碼功能［3］。lncRNA在各種癌癥中表達(dá)失調(diào)，并通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞生長、凋亡、遷移和侵襲促進(jìn)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展［4-5］。lncRNA淋巴細(xì)胞白血病缺失基因1（deleted in lymphocytic leukemia 1，DLEU1）位于染色體13q14.3上，其在慢性淋巴細(xì)胞白血病，多發(fā)性骨髓瘤和其他造血系統(tǒng)惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)并發(fā)揮重要作用［6-7］。本研究預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，DLEU1在NSCLC癌組織中表達(dá)上調(diào)。然而，關(guān)于DLEU1在NSCLC中確切的臨床意義及腫瘤生物學(xué)功能，特別是在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中的作用仍然存在較多未知領(lǐng)域。故本研究旨在分析DLEU1的表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征及生存時間的關(guān)系，并進(jìn)行一系列體外功能試驗探討DLEU1對NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 設(shè)備與試劑 ABI7500實時熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司，倒置顯微鏡和熒光顯微鏡購自日本Olympus公司，E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)購自美國Invitrogen公司。Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和Lipofetamine 2000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；總RNA提取試劑、逆轉(zhuǎn)錄及實時定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑均購自北京Takara公司，引物購自上海Sangon Biotech公司。E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）抗體均購自美國Abcam公司，DLEU1特異性siRNA（si-DLEU1）和對照siRNA（si-NC）購自蘇州GenePharma公司。

1.1.2 臨床標(biāo)本 42例NSCLC患者配對的癌組織和癌旁組織于2008年1月至2012年12月在中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院經(jīng)手術(shù)切除獲得，并在液氮中快速冷凍直至使用。本研究得到中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并獲得所有參與者書面的知情同意。其中，男性患者25例，年齡為21～68歲，平均年齡為（53.18±6.23）歲；女性患者17例，年齡為18～70歲，平均年齡為（52.01±5.59）歲。所有診斷為NSCLC的患者在手術(shù)前均未接受過放療和化療。采用2004年世界衛(wèi)生組織修訂的腫瘤分類系統(tǒng)確定NSCLC的組織學(xué)類型和等級［8］。所有患者的臨床病理信息均被收集，包括患者性別、年齡、吸煙史、原發(fā)腫瘤大小、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期。最終隨訪時間為2017年12月30日，生存時間（overall survival，OS）定義為手術(shù)至患者死亡或手術(shù)至最后記錄點之間的時間。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 4種NSCLC細(xì)胞系（A549、H1299、SPCA1和H358）和正常肺16HBE上皮細(xì)胞由上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫提供。所有細(xì)胞系放置于37℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，給予充足的DMEM培養(yǎng)基，并添加10%FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。

1.2.2 RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄及實時定量聚合酶鏈反應(yīng) 按照說明書流程，采用總RNA提取試劑從組織和細(xì)胞中提取總RNA。采用PrimeScriptTMRT Master Mix進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。然后，每份樣品分為3份，使用SYBRTMSelect Master Mix在ABI7500實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行實時定量聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃ 5 min（聚合酶活化），然后進(jìn)行40個循環(huán)：95℃30 s（變性），55℃ 30 s（退火）和72℃ 30 s（延伸）。以GAPDH作為內(nèi)參對照，引物序列：DLEU1，5′-AGGA GTCTACCTGGAAATG-3′和 5′-GGACAGAGTTAAA CGCAAC-3′；GAPD，5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGC A-3′和5′-AGGT GGAGGAGTGGGTGT-3′。最后，通過2-ΔΔCq方法計算DLEU1表達(dá)倍數(shù)改變［9］。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 si-DLEU1和si-NC的序列分別是5′-GCAGUCUGUUCUGAACAUA-3′和 5′-GUCUGC AGCUGAGAGUAT-3′。轉(zhuǎn)染過程如下：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種到富含完全培養(yǎng)基的6孔板中，待細(xì)胞生長至80%融合度時，根據(jù)說明書，使用Lipofectamine 2000將50 nmoL si-DLEU1和si-NC轉(zhuǎn)染至A549和SPCA1細(xì)胞。48 h后，收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于實時定量聚合酶鏈反應(yīng)以確定轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 細(xì)胞侵襲試驗 采用Matrigel膠包被的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲測定。取轉(zhuǎn)染后的A549和SPCA1細(xì)胞重懸于200 μL無血清DMEM培養(yǎng)基中，并于Matrigel膠包被的Transwell上室中進(jìn)行鋪板，使每孔細(xì)胞數(shù)約為5×104個。下室中添加600 μL的完全培養(yǎng)基作為化學(xué)引誘劑。在37℃培養(yǎng)箱中孵育48 h后，除去上室中的細(xì)胞和基質(zhì)膠，以甲醛固定侵入下室的細(xì)胞，采用結(jié)晶紫染色并在Olympus熒光顯微鏡下計數(shù)。

1.2.5 傷口愈合試驗 將轉(zhuǎn)染后的A549和SPCA1細(xì)胞以1×106個細(xì)胞/孔接種于6孔板中并培養(yǎng)至80%融合度。采用200 μL移液管尖端刮擦單層細(xì)胞，然后將細(xì)胞在不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察傷口愈合情況并在0和24 h拍照，并使用傷愈合率Image J軟件測量傷口寬度。傷口愈合率=（原始傷口寬度-不同時間點的傷口寬度/原始傷口寬度×100%。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法 通過RIPA緩沖液從制好的A549細(xì)胞提取總蛋白質(zhì)樣品，并采用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒定量。用10%聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在室溫下用含5%脫脂牛奶的TBST液封閉2 h，然后在4℃下用抗體（E-cadherin、N-cadherin和Vimentin）孵育過夜。以TBST液洗滌3次后，將膜與辣根過氧化物酶綴合的抗體在室溫下孵育2 h，采用E-Gel Imager凝膠成像系統(tǒng)觀察目的蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。每組試驗至少獨立重復(fù)3次，計量資料以x±s表示。通過配對t檢驗比較DLEU1在NSCLC癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，并采用One-way ANOVA比較A549、H1299、SPCA1、H358和16HBE中DLEU1的表達(dá)水平。采用Chi-square test或Fisher確切概率法確定DLEU1水平與NSCLC臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。應(yīng)用Kaplan-Meier及Log-rank法分析DLEU15表達(dá)與NSCLC患者生存時間的關(guān)系。其余統(tǒng)計分析均采用Student′st檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DLEU1的表達(dá)水平在NSCLC中顯著上調(diào)

DLEU1在NSCLC癌組織的表達(dá)量是癌旁組織的2.11倍（圖1，P＜0.05），42例NSCLC樣本中，DLEU1的表達(dá)在35例中表現(xiàn)出上調(diào)（383.33%），而在7例中表現(xiàn)出下調(diào)（16.67%）。DLEU1在4種NSCLC細(xì)胞系（A549、H1299、SPCA1和H358）的表達(dá)均高于正常肺16HBE上皮細(xì)胞，其中，A549細(xì)胞中DLEU1表達(dá)量最高（圖2，P＜0.05）。

2.2 DLEU1的表達(dá)水平與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

以NSCLC癌組織中DLEU1表達(dá)量的平均值（2.79）為界限，患者中DLEU1的表達(dá)水平＜2.79時指定為低DLEU1表達(dá)組（n=24），表達(dá)水平≥2.79指定為高DLEU1表達(dá)組（n=18）。與低DLEU1表達(dá)組相比，高DLEU1表達(dá)組顯示出較高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（表1，P＜0.05），但與其他參數(shù)無顯著相關(guān)性，包括患者性別、年齡、吸煙史、原發(fā)腫瘤大小、組織學(xué)分級和TNM分期。

圖1 NSCLC癌組織和相應(yīng)癌旁組織中DLEU1表達(dá)水平的比較，*P＜0.05

圖2 4種NSCLC細(xì)胞系和正常肺16HBE上皮細(xì)胞中DLEU1的表達(dá)水平的比較，*P＜0.05

2.3 DLEU1的表達(dá)水平與NSCLC患者生存時間的關(guān)系

生存曲線發(fā)現(xiàn)，與低DLEU1表達(dá)組患者相比，高DLEU1表達(dá)組患者生存時間顯著縮短（圖3，P＜0.05），其中總生存期風(fēng)險比為3.57，95%CI為1.62～7.86。

2.4 干擾DLEU1對NSCLC細(xì)胞遷移的影響

為了探索DLEU1對NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，本研究采用si-DLEU1和si-NC轉(zhuǎn)染至A549和SPCA1細(xì)胞。結(jié)果顯示，與si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-DLEU1的A549和SPCA1細(xì)胞中DLEU1的表達(dá)水平顯著降低（圖4，P＜0.05）。其次，通過傷口愈合試驗觀察DLEU1對A549和SPCA1細(xì)胞遷移的影響。A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC和si-DLEU1 24 h后，傷口愈合率分別為（58.88±7.27）%和（31.78±4.61）%；SPCA1細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-NC和si-DLEU1 24 h后，傷口愈合率分別為（80.15±10.02）%和（42.40±6.33）%。與si-NC相比，轉(zhuǎn)染si-DLEU1可顯著抑制A549和SPCA1細(xì)胞遷移能力（圖5，P＜0.05）。

表1 DLEU1的表達(dá)水平與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系

圖3 DLEU1的表達(dá)水平與NSCLC患者OS的關(guān)系

2.5 干擾DLEU1對NSCLC細(xì)胞侵襲的影響

隨后，采用細(xì)胞侵襲試驗檢測DLEU1對A549和SPCA1細(xì)胞侵襲的影響。與si-NC相比，當(dāng)用si-DLEU1轉(zhuǎn)染A549［（48.65±10.40）vs.（125.39±23.15）］和SPCA1［（198.42±29.67）vs.（346.67±45.01）］24 h后，單個視野下侵襲的細(xì)胞數(shù)量顯著減少（圖6，P＜0.05）。

2.6 干擾DLEU1對NSCLC細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）標(biāo)志物蛋白表達(dá)量的影響

蛋白質(zhì)印跡法顯示，A549細(xì)胞中si-DLEU1組E-cadherin蛋白表達(dá)量是si-NC組的4.41倍，而N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)量分別是si-NC組的0.23和0.17倍。與si-NC組相比，體外干擾DLEU1可顯著增加A549細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)量，而降低N-cadherin和vimentin蛋白表達(dá)量（圖7，P＜0.05）。

圖4 轉(zhuǎn)染si-DLEU1顯著降低A549和SPCA1細(xì)胞中DLEU1的表達(dá)水平，*P＜0.05

圖5 轉(zhuǎn)染si-DLEU1可顯著抑制A549和SPCA1細(xì)胞遷移能力（×400），*P＜0.05

圖6 轉(zhuǎn)染si-DLEU1可顯著抑制A549和SPCA1細(xì)胞侵襲能力（0.1%結(jié)晶紫染色，×400），*P＜0.05

圖7 干擾DLEU1對A549細(xì)胞EMT標(biāo)志物蛋白表達(dá)量的影響，*P＜0.05

3 討論

轉(zhuǎn)移性NSCLC患者預(yù)后差，死亡率極高。因此，靶向抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移對于改善晚期患者的預(yù)后具有重要意義。近年來，越來越多的研究顯示表達(dá)失調(diào)的lncRNAs與NSCLC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，表明這些lncRNAs可能作為NSCLC早期診斷和監(jiān)測預(yù)后的有效生物標(biāo)志物，也可作為NSCLC分子靶向治療的潛在靶點［10-11］。近期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA DLEU1在乳腺癌中高度表達(dá)，并在卵巢癌和胃癌發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，這些結(jié)果表明DLEU1可作為多種腫瘤的潛在診斷生物標(biāo)志物和治療靶點［12-14］。然而，關(guān)于DLEU1在NSCLC中確切的臨床意義及腫瘤生物學(xué)功能，尤其對腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲中的影響尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC中高表達(dá)的DLEU1具有促進(jìn)腫瘤遷移和侵襲的功能。

本研究中，首先探討了DLEU1在NSCLC中的臨床意義。通過采用實時定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測42例NSCLC樣本和4種NSCLC細(xì)胞系中DLEU1的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織和正常肺16HBE上皮細(xì)胞相比，DLEU1在NSCLC癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均表現(xiàn)出顯著上調(diào)，并與患者陽性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較短的生存時間相關(guān)，這與既往報道DLEU1在卵巢癌和胃癌的表達(dá)特征一致［13-14］，表明NSCLC中表達(dá)上調(diào)的DLEU1與患者不良預(yù)后和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。由于DLEU1參與癌癥的發(fā)展，因此人為調(diào)控其在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平已成為腫瘤治療干預(yù)的潛在策略。Shao等［15］發(fā)現(xiàn)干擾DLEU1可顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移和侵襲。同時，Liu等［16］發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)敲低DLEU1的表達(dá)可顯著抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。鑒于以上數(shù)據(jù)，推測DLEU1亦可能調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為。隨后，采用DLEU1特異性siRNA（si-DLEU1）研究其對NSCLC細(xì)胞遷移和侵襲的影響。結(jié)果與推測的一致，轉(zhuǎn)染si-DLEU1可顯著抑制A549和SPCA1細(xì)胞遷移和侵襲能力。

侵襲和轉(zhuǎn)移是癌癥高死亡率的主要原因，EMT與癌細(xì)胞的高侵襲性和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［17］。上皮細(xì)胞失去連接蛋白，如E-cadherin，并獲得間充質(zhì)制標(biāo)志蛋白。如N-cadherin和Vimentin，對促進(jìn)EMT至關(guān)重要。越來越多的證據(jù)表明lncRNAs通過調(diào)節(jié)EMT參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。例如，抑制lncRNA SNHG20可通過與EZH2的增強子結(jié)合調(diào)節(jié)E-cadherin進(jìn)而減少肝癌細(xì)胞增殖和侵襲［18］。過表達(dá)lncRNA ATB通過上調(diào)ZEB1和ZEB2促進(jìn)EMT過程，最終促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移［19］。lncRNA LINC01186通過降低肺癌細(xì)胞EMT抑制遷移和侵襲，而lncRNA SOX2OT通過誘導(dǎo)EMT過程促進(jìn)NSCLC的遷移和侵襲［20-21］。本研究觀察到轉(zhuǎn)染si-DLEU1可顯著下調(diào)N-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)量而上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)量，提示干擾DLEU1主要通過降低EMT進(jìn)而抑制NSCLC細(xì)胞轉(zhuǎn)移行為。

目前，研究者普遍認(rèn)為lncRNA在細(xì)胞中調(diào)控方式主要包括以下途徑：1）通過影響目的基因啟動子轉(zhuǎn)錄；2）通過影響RNA聚合酶Ⅱ的活性；3）通過與目的基因的轉(zhuǎn)錄本形成互補雙鏈；4）通過與目的蛋白質(zhì)結(jié)合影響其活性；5）通過改變目的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位。最新研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可通過競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機制與微小RNA（microRNA，miRNA）結(jié)合從而調(diào)控miRNA介導(dǎo)的靶基因沉默［22］。因此，推測DLEU1可能通過ceRNA機制調(diào)節(jié)某個或者某些miRNAs進(jìn)而促進(jìn)NSCLC遷移和侵襲?；仡櫼寻l(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)多種miRNAs與NSCLC遷移和侵襲密切相關(guān)，包括miR-203、miR-132、miR-577及miR-598等［23］。進(jìn)一步采用生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR-132與DLEU1存在共同的靶基因結(jié)合位點。因此推測DLEU1可能通過ceRNA機制下調(diào)miR-132進(jìn)而促進(jìn)NSCLC遷移和侵襲，但上述推測仍有待進(jìn)一步證明。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)DLEU1在NSCLC組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，并與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存時間相關(guān)。DLEU1可通過調(diào)節(jié)NSCLC的EMT過程發(fā)揮促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的作用，DLEU1可能為NSCLC潛在的治療靶點。