英紅九號紅茶生化成分指紋圖譜初探

凌彩金，范杰文，王秋霜，周巧儀，劉淑媚

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點實驗室，廣東 廣州 510640；2. 華南師范大學化學與環(huán)境學院，廣東 廣州 510006）

英紅九號是從云南大葉有性群體品種中單株分離，經(jīng)30多年系統(tǒng)選育而成的無性系大葉紅茶品種［1］。以英紅九號為原料加工而成的英德紅茶，可與世界上著名的印度紅茶、斯里蘭卡紅茶媲美，被茶界譽為后起之秀，同時與國內的滇紅、祁紅被認定為中國三大著名出口紅茶［2］。目前，英紅九號紅茶的品質審評主要采用感官審評，即在一定的環(huán)境、設備條件下，茶葉評審人按茶葉色澤、香氣、滋味、性狀、葉底分別進行評價，以確定茶葉的品質和等級。但是通過感官審評對英紅九號紅茶的品質進行評定，其結果受審評環(huán)境、設備及審評員工作經(jīng)驗等多種不穩(wěn)定因素的影響。

目前，國內外對茶葉指紋圖譜的研究主要采用高效液相色譜法（HPLC）［3］，以茶葉各色譜峰的峰面積為因子，運用相關系數(shù)、聚類分析等方法構建茶葉HPLC指紋圖譜［4-5］。有研究報道，通過構建綠茶指紋圖譜可用于預測綠茶的抗氧化能力［6］。但在茶葉生化成分、微量元素等常規(guī)理化指標方面而構建的指紋圖譜研究較少。本研究采用國家茶葉標準中的方法測定春、夏、秋三季英紅九號紅茶常規(guī)生化成分的含量，分析不同季節(jié)各生化成分的差異，構建數(shù)字化的英紅九號紅茶生化成分指紋圖譜，為英紅九號紅茶的常規(guī)生化成分指紋圖譜的構建提供參考，在區(qū)分英紅九號與其他品種紅茶，對不同季節(jié)英紅九號紅茶進行分類提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

春、夏、秋三季英紅九號紅茶樣本由廣東省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所提供，共23個樣品；另有來自其他企業(yè)的6個紅茶茶樣作為對照樣品（表1）。茶葉采摘標準為一芽二葉，茶樣采摘、加工處理后密封貯存，貯存條件按GB/T 30375-2013 執(zhí)行［7］。

試劑：磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、堿式醋酸鉛、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、硫酸、鹽酸、茚三酮、氯化亞錫、蒽酮，均為分析純；試驗用水為蒸餾水。

儀器：AE200型分析天平（上海梅特勒-托利多公司）、HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）、PHS-3C型pH計（上海雷磁儀器廠）、725N型紫外分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）、ML-50 型快速水分測定儀（日本AND公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶樣準備 稱取經(jīng)粉碎過孔徑0.250 mm篩的樣品1.000 g（精確至0.001 g），放入250 mL錐形瓶中，加入90 mL沸水，浸提45 min，每隔10 min振蕩1次。浸提完畢后，趁熱過濾，待茶湯冷卻至室溫后加水定容至100 mL，備用。

表1 樣品信息

1.2.2 理化指標測定 水分含量測定采用快速水分測定儀進行測定；茶多酚含量測定采用福林酚法，按GB/T 8313-2008執(zhí)行［8］；游離氨基酸總量測定采用茚三酮比色法，按GB/T8314-2013執(zhí)行［9］；咖啡堿含量測定采用紫外分光光度法，按GB/T8312-2013執(zhí)行［10］；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法［11］；水浸出物含量測定采用全量法，按GB/T8305-2013執(zhí)行［12］。

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007軟件處理，用SPSS19.0軟件進行方差分析和顯著性檢驗。

1.3 生化成分指紋圖譜的構建與分析

通過對不同品種、不同季節(jié)紅茶中各生化成分含量進行分析，檢驗不同品種、不同季節(jié)間的生化成分含量差異。然后以茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖及水浸出物5種生化成分含量為變量，運用SAS 9.4軟件中的系統(tǒng)聚類分析（離差平方和法）對29個茶樣進行聚類，以構建聚類數(shù)字化的英紅九號紅茶生化成分指紋圖譜，并對圖譜進行分析。

具體步驟如下：（1）用標準差標準化方法，對茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、水浸出物等5項指標的原始數(shù)據(jù)進行處理；（2）計算樣品的離差平方和；（3）采用WARD法得到樣品間的平方距離，依據(jù)不同的聚類標準（半偏R2），對各樣本進行聚類，并作出聚類譜系圖。

2 結果與分析

2.1 生化成分含量

采用國家茶葉標準方法測定了春、夏、秋三季英紅九號紅茶與對比茶樣的常規(guī)生化成分含量，結果見表2；對春、夏、秋三季英紅九號紅茶的水分、茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、水浸出物含量進行差異性分析，結果見表3。另外，對英紅九號春茶、云南滇紅春茶及凌云白毫春茶3個紅茶品種的各種生化成分含量進行差異性分析，結果見表4。

表2 春、夏、秋三季英紅九號紅茶與對比茶樣的生化成分含量（%）

表3 英紅九號紅茶不同季節(jié)間各生化成分含量差異性分析

表4 不同品種紅茶生化成分含量差異性分析

2.1.1 茶多酚 從表2可以看出，英紅九號紅茶的茶多酚含量為14.15%，其中夏季英紅九號的茶多酚含量最高、為17.31%，春季的茶多酚含量最低、為13.40%，英紅九號紅茶的茶多酚含量在不同季節(jié)中總體表現(xiàn)為夏季＞秋季＞春季（表2）。已有研究表明，在其他因素較一致的情況下，氣溫、日照影響著鮮葉中生化成分的含量變化［13］，而茶多酚的基本規(guī)律為溫度和光照有利于茶多酚物質的積累［14］。

采用SPSS19.0軟件對英紅九號春、夏、秋三季紅茶的茶多酚含量進行差異性分析，結果（表3）顯示，英紅九號紅茶不同季節(jié)間茶多酚含量差異極顯著。對英紅九號春茶、云南滇紅春茶及凌云白毫春茶3個紅茶品種進行差異性分析，結果（表4）顯示，不同品種紅茶間茶多酚含量差異顯著。

2.1.2 氨基酸 不同季節(jié)的英紅九號紅茶的氨基酸含量為4.00%，其中夏季英紅九號的氨基酸含量最高、均值為4.13%，春季的氨基酸含量最低、均值為3.85%，英紅九號紅茶的氨基酸含量在不同季節(jié)中總體表現(xiàn)為夏季＞秋季＞春季（表2）。氨基酸是重要的滋味物質［15］，其含量則茶葉滋味鮮醇、香氣也好［16］。一般來說，春茶氨基酸含量高于夏秋茶，春茶的滋味也因此更鮮爽、香氣更加濃烈。本研究中，春季英紅九號紅茶的氨基酸含量略低于夏秋季，可能因種植過程中受氣溫、雨量等氣候因素的影響所致。

對英紅九號春、夏、秋三季紅茶的氨基酸含量進行差異性分析，結果（表3）顯示，英紅九號紅茶不同季節(jié)間氨基酸含量無顯著性差異。對英紅九號春茶、云南滇紅春茶、凌云白毫春茶等3個紅茶品種進行差異性分析，結果（表4）顯示，不同品種紅茶間氨基酸含量差異極顯著。

2.1.3 咖啡堿 不同季節(jié)的英紅九號紅茶的咖啡堿含量為3.20%，其中夏季英紅九號的咖啡堿含量最高、均值為3.79%，秋季的咖啡堿含量最低、均值為3.05%，英紅九號紅茶的咖啡堿含量在不同季節(jié)中總體表現(xiàn)為夏季＞春季＞秋季（表2）。茶葉中的咖啡堿含量與茶樹的生長條件、品種、產(chǎn)地、加工方法和采收期等諸多因素相關，一般規(guī)律是遮光條件下栽培的茶樹咖啡堿含量較高，細嫩茶葉比粗老茶葉含量高，夏茶比春茶含量高［17］，本研究結果與此規(guī)律相符。

對英紅九號春、夏、秋三季紅茶的咖啡堿含量進行差異性分析，結果（表3）顯示，英紅九號紅茶不同季節(jié)間咖啡堿含量差異極顯著。對英紅九號春茶、云南滇紅春茶、凌云白毫春茶等3個紅茶品種進行差異性分析，結果（表4）顯示，不同品種紅茶間咖啡堿含量無顯著差異。

2.1.4 可溶性糖 不同季節(jié)的英紅九號紅茶的可溶性糖含量為3.19%，其中春季英紅九號的可溶性糖含量最高、均值為3.70%，夏季的可溶性糖含量最低、均值為2.74%，英紅九號紅茶的可溶性糖含量在不同季節(jié)中總體表現(xiàn)為春季＞秋季＞夏季（表2）?？扇苄蕴鞘遣铚侍鹞兜闹饕镔|，可緩解茶多酚、咖啡堿造成的茶湯苦澀味。春季英紅九號的可溶性糖高于夏季及秋季，故英紅九號春茶的滋味更香甜［18］。

對英紅九號春、夏、秋三季紅茶的可溶性糖含量進行差異性分析，結果（表3）顯示，英紅九號紅茶不同季節(jié)間可溶性糖含量無顯著差異。對英紅九號春茶、云南滇紅春茶、凌云白毫春茶等3個紅茶品種進行差異性分析，結果（表4）顯示，不同品種紅茶間可溶性糖含量差異顯著。

2.1.5 水浸出物 不同季節(jié)的英紅九號紅茶的水浸出物含量為40.49%，其中夏季英紅九號的水浸出物含量最高、均值為42.36%，春季的水浸出物含量最低、均值為36.95%，英紅九號紅茶的水浸出物含量在不同季節(jié)中總體表現(xiàn)為夏季＞秋季＞春季（表2）。水浸出物的主要成分是茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、水溶色素、水溶性果膠、可溶性蛋白、維生素和無機鹽等［19-21］。

對英紅九號春、夏、秋三季紅茶的水浸出物含量進行差異性分析，結果（表3）顯示英紅九號紅茶不同季節(jié)間水浸出物含量差異顯著。對英紅九號春茶、云南滇紅春茶、凌云白毫春茶等3個紅茶品種進行差異性分析，結果（表4）顯示，不同品種紅茶間水浸出物含量無顯著性差異。

2.2 生化成分指紋圖譜的構建與分析

通過對不同品種、不同季節(jié)紅茶中茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖及水浸出物5種生化成分進行分析，結果顯示不同品種的生化成分含量存在差異，不同季節(jié)間的英紅九號的生化成分含量也存在差異。因此，本研究以這5種生化成分含量為變量，運用SAS 9.4軟件中的系統(tǒng)聚類分析（離差平方和法）對29個茶樣進行聚類，結果見圖 1。

結果顯示，在不同的聚類標準（半偏R2）下，聚類結果不同，當半偏R2為0時，每個樣品為單獨的一類；隨著半偏R2標準逐漸放大，29個區(qū)域單位被依次聚類。當半偏R2為0.25時，29個區(qū)域被聚為9類，其中夏季英紅九號紅茶1號和2號為一類，春季英紅九號19、20和22號為一類，秋季英紅九號9、10和12號為一類，秋季英紅九號4、5、13和15號為一類。聚類結果（圖1）表明，英九的春、夏、秋三季紅茶各生化成分含量存在差異。同時，當半偏R2為0.25時，凌云白毫紅茶28號和29號聚為一類，云南滇紅23、24、25和26號為一類，這說明在茶葉生化成分含量上，英紅九號紅茶、凌云白毫及云南滇紅有明顯區(qū)別。

圖1 29個茶葉樣品的系統(tǒng)聚類譜系

由此可見，茶葉中各生化成分含量可作為不同季節(jié)、不同品種紅茶聚類的依據(jù)。以各生化成分含量為變量的聚類分析能對不同季節(jié)的英紅九號紅茶進行歸類，也能準確地區(qū)分英紅九號紅茶與其他品種。

3 結論與討論

本試驗采用國家茶葉標準中的方法測定了不同季節(jié)英紅九號紅茶和其他品種紅茶的茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖、水浸出物5種生化成分的含量。差異性分析發(fā)現(xiàn)，不同季節(jié)英紅九號紅茶的茶多酚、咖啡堿、水浸出物含量差異顯著；不同品種紅茶的茶多酚、氨基酸、可溶性糖含量差異顯著。以茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖和水浸出物含量為因子，用聚類分析的方法建立數(shù)字化英紅九號紅茶生化成分指紋圖譜，在區(qū)分英紅九號與其他品種紅茶、不同季節(jié)英紅九號紅茶進行歸類方面具有可行性。

茶樹作為一種多年生植物，其芽葉中所含的內質成分與成茶品質有著密切的關系。本試驗中，春、夏、秋三季的英紅九號紅茶的茶多酚、游離氨基酸和水浸出物含量隨著季節(jié)的不同而產(chǎn)生差異，總體表現(xiàn)均為夏季含量最高，春季含量最低；可溶性糖含量總體表現(xiàn)為春季最高，夏季最低；英紅九號3個季節(jié)中的茶多酚、咖啡堿及水浸出物含量存在明顯差異。不同季節(jié)英紅九號紅茶生化成分產(chǎn)生差異的原因在于茶樹因生長所處的季節(jié)不同，溫濕度、降水量、日照時間及強度等的差異會對其新梢所含生化成分產(chǎn)生一定的影響。不同品種間，英紅九號紅茶、云南滇紅及凌云白毫春茶的茶多酚、氨基酸及可溶性糖的含量存在顯著差異，說明不同品種間春茶的生化成分組成存在一定的差異，這與相關文獻報道的結果一致［22］。

在系統(tǒng)聚類分析中，當半偏R2為0.25時，能夠區(qū)分春、夏、秋三季英紅九號紅茶以及其他品種紅茶，茶樣中的茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖及水浸出物5種生化成分可作為作為不同季節(jié)英紅九號紅茶、不同品種紅茶聚類的依據(jù)。本實驗室曾采用HPLC法對英紅九號、云南滇紅及凌云白毫品種加工制造的紅茶產(chǎn)品進行分析測定，以各色譜峰的峰面積為引子，采用聚類分析方法構建了鑒定不同品種及不同季節(jié)英紅九號紅茶的HPLC指紋圖譜分析方法［4］。本試驗分析結果中，與前期通過高效液相色譜法得出的系統(tǒng)聚類譜系圖存在差異，分析原因是由于聚類依據(jù)的不同而產(chǎn)生的差異。本試驗是以茶多酚、氨基酸、咖啡堿、可溶性糖及水浸出物5種生化成分含量作為聚類依據(jù)，HPLC指紋圖譜中是以兒茶素類化合物（C、EC、CG、GC、EGC等）的色譜峰面積作為聚類依據(jù)。此外也有研究表明，采用不同的聚類方法，對于相同的數(shù)據(jù)可能有不同的劃分結果，劃分結果也會隨選擇距離的不同而存在差異［23］。本試驗采用的聚類標準（半偏R2）與HPLC指紋圖譜采用的聚類標準（歐氏距離）不同，這也有可能是造成聚類譜系圖差異的原因之一。但總體而言，通過不同數(shù)據(jù)的聚類分析，都可以得出不同季節(jié)的英紅九號紅茶在內質成分的含量上存在一定的差異，可應用于英紅九號紅茶指紋圖譜研究。