大豆乳狀液的組成成分及相關(guān)性質(zhì)的研究

胡 淼，齊寶坤，孫禹凡，謝鳳英，李 楊

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

我國現(xiàn)行的食用植物油加工工藝主要有壓榨法和浸出法兩種。生物解離是一種新興的植物油提取技術(shù)[1]。應(yīng)用生物解離技術(shù)從高含油油料如花生、油菜籽以及紫蘇籽中提取油脂，可以獲得較高的油脂提取率，但是從大豆中提取油脂卻很難獲得較高的提取率，因?yàn)榈鞍着c油脂緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的乳狀液，導(dǎo)致其包裹的油脂難以被釋放分離出來，因而限制了大豆中油脂的提取[2]。

Lamsal等[3]研究發(fā)現(xiàn)乳狀液的主要成分為油脂、水分、多糖、蛋白質(zhì)和磷脂，多糖的存在使乳狀液黏度增大形成水相凝膠，進(jìn)而使油滴顆粒相互分離，蛋白質(zhì)和磷脂對乳狀液的乳化穩(wěn)定性起著重要的作用，但是對于蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及其在乳狀液的界面分布形態(tài)并沒有完全被解釋清楚。由于在生物解離過程中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺轉(zhuǎn)變?yōu)榱字幔淖兞巳闋钜旱姆€(wěn)定性，使得乳狀液難以被破除[4]。

本文主要分析大豆乳狀液中主要組分含量，研究各組分間的相互作用。從乳化相破乳后的油相和非油組分分離的關(guān)聯(lián)性出發(fā)，明確各組分對乳狀液穩(wěn)定性的影響，闡明油脂與各組分間吸附和分離關(guān)系；并通過測定乳狀液粒徑和流變學(xué)特性分析乳狀液的界面特性，為破乳提供力學(xué)和質(zhì)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

大豆：東農(nóng)-42；Protex 6L堿性蛋白酶：杰能科生物工程有限公司；Alcalase 2.4L堿性蛋白酶：諾維信生物有限公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇：美國Sigma公司；磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，考馬斯亮藍(lán)G-250，丙酮，無水乙醇，甲醇，冰乙酸。

1.1.2 儀器與設(shè)備

JE-502電子天平，F(xiàn)A2004電子分析天平，F(xiàn)W100型高速萬能粉碎機(jī)，擠壓膨化機(jī)(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)自制)，ZNCL-BS電動(dòng)磁力攪拌器，HH-4電熱恒溫水浴鍋，BX53正置顯微鏡(OLYMPUS)，LGJ-1冷凍干燥機(jī)，GL-21M高速冷凍離心機(jī)，400型超導(dǎo)核磁共振光譜儀(德國Brucker公司)，mini-PROTEAN Tetra電泳儀(美國Bio-radLaboratories公司)，TNZ1-5700傅里葉紅外光譜儀(英國Thermo Fisher公司)，F(xiàn)2000熒光光譜儀(日本日立(Hitachi)公司)，Mastersizer 2000粒度儀(英國馬爾文儀器有限公司)，LGR20-W臺式高速冷凍離心機(jī)，BGZ-246電熱鼓風(fēng)干燥箱，KDN-103F自動(dòng)定氮儀，HYP-1040四十孔消化爐。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解及乳狀液分離工藝

參照王心剛等[5]優(yōu)選的水酶法提取大豆油脂工藝參數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。擠壓膨化處理后的大豆粉與蒸餾水按照1∶6的料液比混合置于60℃的恒溫水浴鍋中加熱，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.0左右，加入Protex 6L堿性蛋白酶，酶解3 h后，在100℃下加熱10 min滅酶處理，之后在4 500 r/min下離心20 min，離心后吸取游離油，將其余液體部分倒入分液漏斗，靜置24 h分層后，將上層的乳狀液分離。

1.2.2 乳狀液成分測定

乳狀液用蒸餾水洗滌后分成4份，然后離心(15 000g，30 min，25℃)回收，儲存在4℃下待分析。

乳狀液中粗脂肪含量測定采用酸水解的方法，參照AOCS 922.06；粗蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5—2003；總碳水化合物測定采用Fox等[6]的方法；水分含量測定采用105℃烘箱法，參照GB/T 5009.3—2003；總磷脂含量測定采用鉬藍(lán)比色法，參照GB/T 5537—2008。

1.2.3 乳狀液表面蛋白含量的測定

表面蛋白含量測定按照Agboola等[7]的方法。

1.2.4 乳狀液中蛋白的提取

乳狀液水相中蛋白提取方法采用丙酮沉淀法[8]。將乳狀液與冷丙酮按照質(zhì)量體積比20∶1在-18℃下反應(yīng)2 h，在12 000g、4℃下離心15 min，除去上清液，將沉淀繼續(xù)用冷丙酮洗滌4～5次，直到溶劑由黃色變成無色，將沉淀中溶劑揮發(fā)后冷凍干燥得到蛋白，放入4℃冰箱備用。

1.2.5 乳狀液中蛋白相關(guān)研究

1.2.5.1 紅外光譜的測定

將提取的蛋白樣品粉碎后過100目篩，在40℃烘箱中烘干12 h，然后在紅外燈下進(jìn)行研磨處理。稱取約2 mg的待測樣品，加入約200 mg溴化鉀，在瑪瑙研缽中研磨約15 min，隨后進(jìn)行壓片處理，壓片機(jī)在1.4 MPa壓力下約保持1 min，然后將制得的均勻透明薄片放入紅外光譜儀中進(jìn)行測定。測定條件為：掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描信號累加64次。每種處理樣的圖譜掃描重復(fù)3次。采用Peakfit分析譜圖。

1.2.5.2 SDS-PAGE電泳分析

采用SDS-PAGE分析乳狀液中蛋白相對分子質(zhì)量[9]。

具體方法：將蛋白樣品與上樣緩沖溶液按2∶1的比例混合，在100℃下加熱90 s，蛋白的上樣質(zhì)量濃度為6 mg/mL，上樣量為10 μL，其中分離膠的濃度為12%，濃縮膠的濃度為5%，電泳開始時(shí)的初始電流為10 mA，樣品進(jìn)入分離膠后改成20 mA。利用0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250溶液進(jìn)行染色，時(shí)間為30 min，之后利用甲醇和冰乙酸對樣品進(jìn)行脫色處理，直到溶液澄清透明為止。

1.2.5.3 熒光光譜的測定

依據(jù)尹壽偉[9]的方法。將蛋白樣品分別分散于0.01 mol/L pH為7.0的磷酸緩沖液中，配制蛋白質(zhì)量濃度為0.15 mg/mL的溶液。測定條件：熒光光譜的激發(fā)波長為290 nm，光譜的掃描范圍為300～400 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫的寬均為5 nm。

1.2.6 乳狀液中磷脂組成分析

1.2.6.1 毛油提取

向乳狀液中加入200 mL甲醇，混合搖勻加入400 mL氯仿繼續(xù)混勻，在室溫下磁力攪拌4 h，然后采用布式漏斗回收固體和萃取液，將固體反復(fù)萃取，合并萃取液，將萃取液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，繼續(xù)用氯仿、甲醇、0.74%KCl溶液按照體積比為8∶4∶3進(jìn)行洗滌，得到的毛油儲存在-26℃下備用。

1.2.6.2 濃縮

10 g毛油與45 mL正己烷和15 mL乙醇混合，5 min達(dá)到平衡后收集乙醇相，此過程重復(fù)10次，之后乙醇提取物與130 mL氯仿和111 mL EDTA(pH 7)混合，收集氯仿相，采用硫酸鈉干燥，然后除去溶劑的濃縮油在-26℃儲存待用。

1.2.6.3 磷脂的測定

乳狀液磷脂測定采用31P NMR分析。濃縮油(80～90 mg)加入TPP(10 mg，固體)，溶解于氯仿、甲醇、EDTA組成混合液中，劇烈振蕩搖勻，離心后將下層轉(zhuǎn)移到5 mm NMR瓶中進(jìn)行測定。

31P NMR測定條件：探頭溫度29℃，脈沖寬度22 μs，掃描寬度9 718 Hz，采集時(shí)間1～2 s，間隔10 s，掃描次數(shù)256次。

1.2.7 乳狀液性質(zhì)的測定

1.2.7.1 乳狀液粒徑及電位的測定

采用粒度分析儀測定乳狀液體積加權(quán)平均值(D4,3)。將小部分乳狀液分散在50 mL蒸餾水中，保持粒徑數(shù)值在測定范圍內(nèi)，大豆油滴的折射指數(shù)(RI)為1.47，分散劑的RI為1.333。測定在室溫下進(jìn)行，吸光值為0.001。

采用Zeta電位儀測定乳狀液的Zeta電位。將大豆乳狀液樣品用50 mmol/L pH 7的磷酸緩沖液稀釋至樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的溶液后，在25℃下進(jìn)行測定。

1.2.7.2 乳狀液激光共聚焦分析

分別將0.01%的尼羅紅和0.01%的尼羅藍(lán)溶解在異丙醇中，制成染色液。取1 mL乳狀液樣品，分別加入40 μL尼羅紅染色液和40 μL尼羅藍(lán)染色液，混合均勻后，染色20 min，取染色后的乳狀液樣品1滴放在帶凹槽的載玻片上，蓋上蓋玻片并用甘油密封。采用油鏡進(jìn)行圖像的采集，觀察的分辨率為1 024×1 024，圖像采集的范圍為5～45 μm。

1.2.7.3 乳狀液流變性質(zhì)的測定

采用流變儀測定乳狀液的流變學(xué)變化。測定的剪切速率為5 s-1，升溫速度為5℃/min，觀察此時(shí)乳狀液的黏度隨溫度的變化規(guī)律。在25℃下，采用流變儀觀察黏度隨剪切速率的變化規(guī)律。

1.2.7.4 正置顯微鏡分析

用吸管取2～3滴乳狀液于干凈干燥的載玻片上，輕輕地加上蓋玻片后，置于顯微鏡明場放大100倍進(jìn)行觀察。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

為保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，每組試驗(yàn)進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，并將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差分析。采用SPSS 19統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳狀液組成

2.1.1 乳狀液的化學(xué)組成(見表1)

表1 大豆粉及乳狀液主要成分 %

注：表中數(shù)據(jù)為濕基含量。

由表1可知，乳狀液中的兩種主要成分為甘油三酯(油脂)和水，含量分別達(dá)到66%和29%。此外，還有少量的碳水化合物、蛋白質(zhì)和磷脂。雖然乳狀液中蛋白質(zhì)含量僅占4.7%，磷脂含量僅占0.8%，但由于其特殊的雙親結(jié)構(gòu)對乳狀液的形成和穩(wěn)定起著重要的作用。碳水化合物主要包括淀粉和纖維顆粒，可有效增加吸附層界面黏度，降低界面張力，同時(shí)在液滴間形成靜電斥力，阻礙液滴的絮凝和聚集，提高了乳狀液的穩(wěn)定性。

2.1.2 乳狀液中蛋白分析

乳狀液中蛋白的SDS-PAGE圖見圖1，內(nèi)源熒光光譜圖見圖2。

由圖1可知，大豆分離蛋白的亞基分布范圍較廣，相對分子質(zhì)量主要分布在17～20 kDa和48～63 kDa。而乳狀液中蛋白在17～20 kDa范圍內(nèi)的條帶明顯變淺，在48～63 kDa范圍內(nèi)的條帶全部消失，亞基分布范圍較窄且相對分子質(zhì)量較小，相對分子質(zhì)量主要分布在11～17 kDa范圍內(nèi)。相比于大豆分離蛋白，大豆乳狀液中蛋白相對分子質(zhì)量減小的原因主要是由于水酶法提取大豆油過程中蛋白酶的水解作用，使大豆蛋白水解成相對分子質(zhì)量較小的多肽導(dǎo)致的。低相對分子質(zhì)量蛋白可能是oleosin蛋白，其包圍在油體表面并且具有雙親性，一般相對分子質(zhì)量分布在15～26 kDa，這取決于蛋白質(zhì)亞型和植物種類[10]。

注：M.蛋白質(zhì)標(biāo)樣Marker；1.大豆分離蛋白；2.乳狀液中蛋白。

圖1大豆乳狀液中蛋白的SDS-PAGE圖

圖2 大豆乳狀液中蛋白的內(nèi)源熒光光譜圖

由圖2可知，大豆乳狀液中蛋白的熒光強(qiáng)度為377.82±6.86時(shí)，有最大吸收波長λmax，為(346.15±0.27)nm。Keerati-u-rai等[11]對油-水界面中的大豆蛋白的內(nèi)源熒光光譜進(jìn)行測定與分析，得到與本文類似的研究結(jié)果。Miriani等[12]采用熒光光譜對吸附在乳狀液界面的大豆蛋白結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行研究，與天然的蛋白質(zhì)(β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白)相比，乳狀液中蛋白的最大發(fā)射波長由7 nm增大到12 nm，即發(fā)生紅移，表明蛋白吸附后更多的色氨酸殘基暴露到水相中，三級結(jié)構(gòu)變得更加松散。位于蛋白質(zhì)亞基中的色氨酸殘基暴露到水相后，色氨酸的疏水區(qū)域被固定在乳狀液界面中，起到穩(wěn)定乳狀液的作用。

圖3為大豆乳狀液中蛋白的紅外光譜圖。

圖3 大豆乳狀液中蛋白的紅外光譜

采用Peakfit軟件對蛋白紅外光譜酰胺Ⅰ帶進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)紅外去卷積光譜擬合，評價(jià)蛋白二級結(jié)構(gòu)類型和含量，酰胺Ⅰ帶擬合圖譜中各子峰與蛋白二級結(jié)構(gòu)對應(yīng)關(guān)系見表2。

表2 乳狀液中蛋白二級結(jié)構(gòu)信息

2.1.3 乳狀液中磷脂組成

圖4為分別為大豆粉、膨化大豆粉和大豆乳狀液中磷脂含量。

注：PA.磷脂酸；PG.磷脂酰甘油；DPG.雙磷脂酰甘油；PE.磷脂酰乙醇胺；PS.磷脂酰絲氨酸；PI.磷脂酰肌醇；PC.磷脂酰膽堿。

圖4大豆粉、膨化大豆粉和大豆乳狀液中磷脂含量

由圖4可知，擠壓膨化后PA含量升高到(14.1±0.98)%，比大豆粉中的PA含量(9.12±1.13)%高；PC和PE含量降低，分別由48.26%降低到45.5%，20.11%降至18.2%，這可能是在擠壓膨化過程中需要將水分調(diào)節(jié)到14%，而14%恰好是磷脂酶D的活躍水分，磷脂酶D可能水解PC和PE。與膨化物料相比，大豆乳狀液磷脂中的PA含量升高，PC和PE含量降低，PI、DPG和PS全過程變化不明顯，可能由于在水酶法酶解過程中，磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺轉(zhuǎn)變?yōu)榱字幔@種變化可能會影響乳狀液的穩(wěn)定性[14-15]。

2.2 乳狀液穩(wěn)定性分析

2.2.1 乳狀液的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

經(jīng)測定，大豆乳狀液的界面蛋白含量為(10.79±0.84)mg/m2，而Tcholakova等[15]研究發(fā)現(xiàn)在油滴界面能夠形成單層蛋白膜穩(wěn)定乳化體系，形成穩(wěn)定乳狀液的最低界面蛋白含量為1～2 mg/m2，生物解離得到的大豆乳狀液的界面蛋白含量是形成穩(wěn)定乳狀液最低界面蛋白含量的好幾倍，表明乳狀液的油滴界面由多層蛋白膜包裹形成，足以形成一個(gè)穩(wěn)定的多層乳液。

乳狀液的平均粒徑可以反映液滴的聚集情況。經(jīng)測定大豆乳狀液的平均粒徑(D4，3)為(11.13±0.58)μm，比花生水酶法提油形成的乳狀液粒徑小，說明水酶法提取大豆油過程中能夠形成穩(wěn)定的乳狀液體系。研究表明乳狀液由于靜電排斥作用的存在，帶電量越多，其穩(wěn)定性越好，大豆乳狀液的Zeta電位值為(-21.57±1.88)mV，說明乳狀液具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。采用正置顯微鏡觀察乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)(見圖5A)，可以看出本試驗(yàn)的乳狀液中油滴尺寸較小，且分散較均勻，這也說明了未處理的乳狀液的穩(wěn)定性較好。通過激光共聚焦觀察乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)(見圖5B)，可以看出油滴被蛋白包裹，使得油脂無法聚集釋放，形成相對穩(wěn)定的乳狀液。

圖5 乳狀液的顯微結(jié)構(gòu)圖(A)和激光共聚焦圖(B)

2.2.2 乳狀液的流變性質(zhì)(見圖6)

由圖6A可知，隨著剪切速率的增加，乳狀液的黏度逐漸降低，最終達(dá)到平衡。乳狀液呈現(xiàn)出剪切變稀的性質(zhì)，在低剪切速率(0.1～2 s-1)下，乳狀液黏度由300 Pa·s迅速下降到1 Pa·s以下。此后，再繼續(xù)增加剪切速率，乳狀液黏度進(jìn)一步下降，但是下降的速度緩慢，最終在高剪切速率(8～10 s-1)下，乳狀液黏度變化不顯著。這表明乳狀液黏度受剪切作用的影響較大，較小的剪切速率就能破壞乳狀液油水界面膜的結(jié)構(gòu)，使乳狀液的穩(wěn)定性下降，這可能是由于蛋白質(zhì)、磷脂等兩性物質(zhì)穩(wěn)定的乳化體系受到剪切作用時(shí)，分子之間的交聯(lián)作用被破壞導(dǎo)致的。

圖6 不同剪切速率和溫度下乳狀液的黏度

由圖6B可知，隨著溫度的升高，乳狀液黏度呈先降低后稍有增加的趨勢。當(dāng)溫度由25℃升高到90℃時(shí)，乳狀液黏度顯著降低。這可能是由于提高溫度加快了乳狀液中分子的熱運(yùn)動(dòng)，破壞了油、水界面膜中分子之間的作用力，減弱了分子間的相互作用，使體系的流動(dòng)性增加，黏度降低。此外，熱處理會使吸附在油滴表面的蛋白發(fā)生熱變性，使其失去乳化能力，導(dǎo)致乳化體系被破壞，從而降低了體系黏度。當(dāng)溫度超過90℃后，黏度稍有增加。這可能是由于高溫導(dǎo)致水分的嚴(yán)重蒸發(fā)而蛋白還未變性，這會使體系濃度急劇增大，蛋白質(zhì)等分子聚合形成較大聚集物，導(dǎo)致體系黏度稍有增加。Dimitrova等[16]研究表明，隨著溫度的升高，乳狀液由非絮凝狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樾跄隣顟B(tài)，使乳狀液的黏度發(fā)生改變，導(dǎo)致乳狀液穩(wěn)定性降低。Hanmoungjai等[17]采用Alcalase 堿性蛋白酶提取米糠油，酶解后將得到的乳狀液煮沸破壞乳化體系，使油脂與蛋白分離，這說明高溫能夠使乳狀液的穩(wěn)定性降低，這與本研究的結(jié)果相似。

3 結(jié) 論

本文探究了生物解離大豆乳狀液的成分及各組分的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)生物解離大豆乳狀液的主要成分為油脂、水、蛋白質(zhì)和磷脂，蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量降低，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)松散，二級結(jié)構(gòu)的含量與大豆蛋白結(jié)構(gòu)相似，磷脂主要由PC、PE、PG、PI、PA、DPG和PS組成，其中PC含量最高，蛋白質(zhì)和磷脂對穩(wěn)定乳狀液起關(guān)鍵作用。同時(shí)，表面蛋白起著穩(wěn)定乳狀液的作用，乳狀液的穩(wěn)定性受剪切速率和溫度的影響。通過以上的研究可以發(fā)現(xiàn)利用酶解的作用可以有效地破除乳狀液，提高油脂的產(chǎn)率。