綿羊IGF- I基因II類變異剪接體生物信息學及組織表達分析

宋旭婷，翟羽飛，張嘉楠，亓美玉，王志鵬，付 晶，姚玉昌*

（1.黑龍江普通高等學校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江哈爾濱 150030；3.黑龍江省農業(yè)科學院畜牧研究所，黑龍江哈爾濱 150086）

胰島素樣生長因子-1（Insulin Like Growth Factor I，IGF-I）是一種物種間高度保守的多功能肽，在哺乳動物中由70個氨基酸殘基和3個分子內二硫鍵組成，主要由肝臟分泌產生，對生長、生殖、代謝、免疫和多種疾病具有調節(jié)功能[1-2]。IGF-I基因在培育動物新品種中發(fā)揮重要作用。有研究表明，14月齡時轉IGF-I基因綿羊后代公羊和母羊的產毛量分別提高了9.2%和3.4%[3]；轉IGF-I基因豬的瘦肉率提高10%，脂肪減少20%[4]。

RNA的可變剪接（Alternative Splicing）是真核生物基因表達調控的重要形式，可變剪接在生物界普遍存在，其中95%的人類基因和40%以上的植物基因存在著可變剪接現(xiàn)象[5-6]。IGF-I基因在表達時存在外顯子互斥現(xiàn)象，進而調節(jié)著基因表達的差異性和蛋白質功能的多樣性[7]。目前，在人類中已發(fā)現(xiàn)包括IGF-IEa、IGF-IEb和IGF-IEc至少3種類型[8]，在鼠中也已發(fā)現(xiàn)包括IGF-IEa和IGF-IEb（該型與人中的IGF-IEc型的剪接方式一致）在內的2種類型[9]，在豬、牛和鹿等物種也有相關研究報道[10-12]。但目前關于綿羊IGF-I基因的可變剪接方式還未明晰，產生的變異剪接體類型有待進一步揭示。

IGF-I基因在不同物種間高度保守，本研究基于已發(fā)表的綿羊IGF-I基因I類變異剪接體類型[13]，以東北細毛羊為實驗材料，探討IGF-I基因II類變異剪接體的生物學特性及組織表達規(guī)律，為揭示IGF- I基因不同變異剪接體的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物選擇來自東北農業(yè)大學綿羊新品種繁育基地的30日齡和36月齡東北細毛羊公羊各3只，屠宰后立即取心臟、肝臟、肌肉、脾臟、肺臟、腎臟、腸、胃、皮膚、脂肪、膀胱和睪丸組織樣，于液氮中速凍后，-80 冰箱保存。

1.2 引物信息 比較分析牛、豬、鹿等物種IGF-I基因的可變剪切模式及序列同源性，明確目標序列高度保守區(qū)域，設計2對克隆和半定量引物，特異性引物1（F:5'-ACCCACCCTGACCTGCTGT-3'；R:5'-CATTCT TCGCTCTTTAGGAAGGG-3'）、特異性引物2（F:5'-ACCCACCCTGACCTGCTGT-3'；R:5'-TTCAGTTTCTA GCTCCAGTCTCTC T-3'）、半定量引物R1（F:5'-CAA ACAAAAATGGTTACACCTACAC-3'；R:5'-AAATGT

ACT TCCTTCTGAGCCTTGG-3'）、半定量引物R2（F:5'-CAAACAAAAATGGTTACACCTACA C-3′；R:5′-CCCTCCTGGATGTTTCTTTGG-3'） 和β-actin 基 因 引 物（F:5'-AGATGTGGATC AGCAAGCAG-3'；R:5'-CCAATC TCATCTCGTTTTCTG-3'）。

1.3 總RNA提取及cDNA合成 采用液氮研磨結合RNAiso Plus裂解法（9109，TaKaRa）提取12個組織總RNA，利用紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA純度和濃度。反轉錄cDNA按照試劑盒說明書（RR047A，TaKaRa）的具體操作步驟完成。

1.4 全長編碼區(qū)克隆鑒定 以東北細毛羊肝臟池為模板，利用1.2中列出的特異性引物1和2分別擴增目的序列。PCR擴增條件及克隆方法參照之前的報道[13]。純化后帶有目標序列的pMD 18-T克隆質粒測序，將拼接比對后的完整序列進行后續(xù)生物信息學預測。DNAMAN和NCBI BLAST在線比對獲得序列物種同源性等信息。

1.5 預測網站 將已克隆獲得片段進行開放閱讀框區(qū)域預測。GenBank數(shù)據(jù)庫查找并下載Class 2-Ea和Class 2-Eb氨基酸序列，用于構建系統(tǒng)進化樹，其他相關生物學預測方法詳見參考文獻[13]。

1.6 組織表達分析 考慮到IGF-I基因的剪接方式以及引物的特殊性，本研究選擇半定量PCR檢測IGF-I基因不同變異剪接體在12種組織樣品中的表達情況。具體方案參照Zhang等[12]研究方法。

1.7 統(tǒng)計分析 使用Image J軟件獲取目的條帶灰度值，采用SPSS 18.0軟件單因素方差分析法對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。

2 結果與分析

2.1 綿羊IGF-I基因克隆 以東北細毛羊肝臟池cDNA為模板，RT-PCR擴增結果顯示均出現(xiàn)特異性擴增條帶，測序后證明獲得了2種變異剪接體（圖1和圖2）。綜合比對嚙齒類、類人猿等哺乳動物IGF-I基因的可變剪接特征，并與課題組之前在綿羊肝臟池中獲得的2條綿羊IGF-I基因I類（NM_001009774.3，MG572781）序列對比后發(fā)現(xiàn)，本研究新獲得的片段是綿羊IGF-I基因II類變異剪接體，即為綿羊IGF-I基因II類Ea型 （IGF-Iclass 2-Ea, GenBank登錄號：MG572782）和IGF-I基因 II類 Eb型（IGF-Iclass 2-Eb，GenBank登 錄 號：MG572783）。

圖1 綿羊IGF-I基因4種變異剪接體PCR擴增結果

圖2 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體結構模式圖

2.2 2種變異剪接體生物信息學預測分析結果

2.2.1 組成分析 本研究獲得的綿羊IGF-I基因II類變異剪接體組成分析與其他物種結果相一致（表1）。IGF-I基因II類Ea型（序列長度為485 bp）ORF位于42～459 bp核苷酸，預測編碼蛋白質長度是138 aa；IGF-I基因II類Eb型（序列長度為561 bp）ORF位于42～560 bp核苷酸，預測編碼蛋白質長度是172 aa（圖3）。信號肽在線預測結果表明，2種變異剪接體1～33個氨基酸為信號肽區(qū)域，剪切點位于33～34氨基酸處（圖4）。

2.2.2 系統(tǒng)進化樹分析 由圖5可見，綿羊IGF-I基因II類Ea型與山羊（Capra hircus）在一個小分支上，遺傳距離相對較近；與嚙齒類（Rodents）和靈長類（Primates）遺傳距離相對較遠。綿羊的IGF-I基因II類Eb型與牛（Bos taurus）在一個小分支上，遺傳距離較近；與小鼠（Mus musculus）遺傳距離較遠，這2種剪接變異體的系統(tǒng)進化樹分析結果符合物種進化規(guī)律。

表1 綿羊IGF-I 基因序列組成分析

圖3 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體的氨基酸序列比對

圖4 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體信號肽序列預測結果

圖5 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體系統(tǒng)進化樹分析結果

2.2.3 蛋白質基本理化性質預測 在線預測蛋白質理化性質結果表明IGF-I基因II類Ea型預測編碼138 aa，相對分子質量為15 149.42，理論等電點（PI）為9.44，由19個氨基酸組成，其中絲氨酸達到10.1%，異亮氨酸僅為0.7%。分子式為C654H1048N194O196S12；氨基酸的最大疏水性為2.756，最小值為-1.978（圖6-a）。IGF-I基因II類Eb型預測編碼172 aa，相對分子質量為19 070.93， PI為9.93，由19個氨基酸組成，其中賴氨酸達到9.3%，異亮氨酸僅為0.6%。分子式為C816H1331N253O246S14；氨基酸最大疏水性為2.756，最小值為-3.067（圖6-b）。

圖6 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體蛋白親疏水性預測結果

2.2.4 功能域預測 在線預測亞細胞定位結果（表2）表明，2種變異剪接體均是分泌蛋白，與IGF-I的功能相一致，主要定位于分泌途徑，并且該方法與信號肽在線預測軟件（SignalP 4.0）結果一致，表明存在信號肽區(qū)域。

表2 綿羊IGF-I基因序列TargetP亞細胞定位預測

2.2.5 共價修飾預測 利用在線網站預測2種變異剪接體共價修飾位點的存在數(shù)量。磷酸化修飾位點在線預測結果（圖7）顯示，IGF-I基因II類Ea型有17處可能的磷酸化修飾位點，分別位于絲氨酸（n=10）、蘇氨酸（n=5）和酪氨酸（n=2），IGF-I基因II類Eb型有20處可能的磷酸化修飾位點，分別位于絲氨酸（n=12）、蘇氨酸（n=6）和酪氨酸（n=2）。糖基化修飾位點在線預測結果顯示，IGF-I基因II類Ea型與Eb型分別有9個和11個潛在的糖基化位點。

2.2.6 結構域預測 二級結構在線預測結果（圖8-a和8-b）表明，IGF-I基因II類Ea型編碼的138個氨基酸中，α-螺旋數(shù)量為47個（34.06%），β-折疊數(shù)量為9個（99%），無規(guī)則卷曲數(shù)量為82（59.42%）；IGF-I基因II類Eb型編碼的172個氨基酸中，α-螺旋數(shù)量為68個（39.53%），β-折疊數(shù)量為14個（8.14%），無規(guī)則卷曲數(shù)量為90個（52.33%），2種變異剪接體均不存在β-轉角結構。三級結構在線預測結果（圖8-c和8-d）顯示2種變異剪接體均為彎曲螺旋狀。

圖7 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體磷酸化位點預測結果

圖8 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體蛋白質結構域預測結果

2.6 組織表達檢測 如圖9所示，肝組織中變異剪接體的表達水平最高，其次為脂肪、胃、睪丸、肌肉和皮膚，心、脾、肺、腎、腸、膀胱組織的表達水平較低。在胃中，2種剪接變異體在羔羊期的表達水平均極顯著高于成羊期（P＜0.01）；在睪丸中，IGF-I基因II類Ea型在羔羊期的表達水平顯著高于成羊期（P＜0.05）；在其余檢測的組織中，2種變異剪接體的表達水平在羔羊期和成羊期沒有顯著差異（P＞0.05）。綜合比較分析2個變異剪接體多組織間的表達水平，發(fā)現(xiàn)II類Ea型的表達水平高于Eb型，為主要的轉錄本類型。

圖9 綿羊IGF-I基因II類變異剪接體的組織表達情況

3 討 論

IGF-I是體內普遍存在的生長因子，對綿羊生長、肉質和羊毛產量具有顯著的促進作用[14-15]。分析多物種IGF-I基因前體RNA的剪接模式時發(fā)現(xiàn)，IGF-Iclass 1-Ea型誘導成肌細胞分化和融合形成肌管，而IGF-Iclass 1-Eb抑制成肌細胞的最終分化，從而積累更多的成肌細胞形成次級肌管[16-17]。本研究成功獲得了綿羊IGF-I基因 II類Ea和Eb型，其中Ea型（GenBank登錄號：MG572782）編碼138個氨基酸，Eb型（GenBank登錄號：MG572783）編碼172個氨基酸。IGF-I基因II類與I類變異剪接體之間相比較，包含了99 bp的差異剪接區(qū)域，該區(qū)域為綿羊中新發(fā)現(xiàn)的剪接區(qū)域，構成了IGF-I基因II類變異剪接體的5′UTR和信號肽區(qū)域。這也是IGF-I基因I類和II類變異剪接體的主要差異，導致了氨基酸組成上的不同，進而引發(fā)蛋白質基本理化性質上（PI和親疏水性等）的差異，但總體上IGF-I基因I類和II類變異剪接體相類似，均為水溶性氨基酸。目前，關于IGF-I基因II類變異剪接體的研究還不完善，因此進行系統(tǒng)進化樹分析時可用的參考序列較少。本研究表明，綿羊與牛和山羊具有較高的同源性，這也符合物種進化規(guī)律。

含有信號肽結構的蛋白質可以通過內質網引導蛋白質肽鏈進入內質網腔內，然后分泌到胞外[13,18]。本實驗對新獲得的IGF-I基因II類變異剪接體在線預測信號肽后發(fā)現(xiàn)，第33～34位氨基酸為其預測切割位點，這也是IGF-I基因II類變異剪接體與I類變異剪接體的主要差異。有研究表明，IGF-I基因I類和II類變異剪接體相比較，II類變異剪接體含有更短的信號肽基序，這一特點將引發(fā)更有效的分泌功能[19]。本研究結果表明，IGF-I基因II類的2種變異剪接體在亞細胞定位、蛋白質二級結構和三級結構預測結果方面相類似，沒有發(fā)現(xiàn)明顯區(qū)別，而且它們都包括一定數(shù)量的共價修飾位點。一般情況下，肽鏈容易在包含游離羥基并且不帶電荷的氨基酸殘基（色氨酸、絲氨酸和蘇氨酸）上發(fā)生磷酸化修飾，而此處帶電狀態(tài)的改變，將導致結構及活性發(fā)生變化。同磷酸化修飾相比較，糖基化修飾范圍較廣，其主要發(fā)生場所位于內質網內，蛋白質經過修飾后肽鏈可減弱或消除消化酶的作用，引導蛋白質的正確折疊，并賦予多種生物學活性以及傳導信號的功能。

本研究對IGF-I基因II類變異剪接體的多組織表達分析結果表明，Ea型和Eb型在檢測的12種組織中均表達，但表達水平存在明顯的差異，其中以肝臟中的表達最高，這與IGF-I的生物學功能相適應。肝臟作為IGF-I的主要合成分泌器官，機體中約75%的循環(huán)水平IGF-I來自肝臟，與IGF-IR相互作用后，行使其生物學功能。除肝臟外，2種變異剪接體在胃和脂肪中的表達水平也相對較高。檢測胃中IGF-I基因II類變異剪接體的表達規(guī)律時發(fā)現(xiàn)，羔羊期2種變異剪接體的表達量顯著高于成羊期，推測這與羔羊期機體的快速生長、消化機能的逐漸成熟以及較高的日糧營養(yǎng)水平相適應[20-21]。此外，針對睪丸組織的研究表明，IGF-I基因II類Ea型在羔羊期的表達水平顯著高于成羊期，這可能與生殖器官的逐步發(fā)育成熟有關，IGF-I基因對動物睪丸組織液、睪丸間質細胞類固醇激素的合成有重要影響，進而調節(jié)繁殖性能[22]?？傮w上，本研究表明，相對于Eb型，Ea型是主要的表達類型，在大多數(shù)組織均有表達，且表達水平較高，這與Oberbauer等[23]在鼠和牛中的研究結果相一致，這一現(xiàn)象產生的原因可能是由于二者在E結構域上的差異導致。

綜上所述，本研究克隆得到了綿羊IGF-I基因II類的2種變異剪接體，并分析它們的結構特性及在主要組織器官中的時空表達規(guī)律，為揭示IGF-I基因不同變異剪接體的生物學功能奠定基礎。