布魯氏菌DnaK基因缺失株的構(gòu)建及其功能初步評價

張俊波，印雙紅，易繼海，張 紅，方維煥，王嘉福，郭 飛，李志強，陳創(chuàng)夫

(1.銅仁學院 農(nóng)林工程與規(guī)劃學院/銅仁市文化科技產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究中心，貴州 銅仁 554300；2.浙江大學 動物科技學院，浙江 杭州 310058；3.銅仁學院大健康學院，貴州 銅仁 554300；4.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832000；5.商丘師范 學院生物與食品學院，河南 商丘 476000)

布魯氏菌病是一種嚴重危害人和家畜健康的人獸共患傳染病[1]。布魯氏菌為革蘭氏陰性的兼性胞內(nèi)寄生菌，其急性期的臨床特點主要為發(fā)熱、關(guān)節(jié)和肌肉痛等；動物布魯氏菌病的特點是生殖器官壞死和肉芽腫的形成，引起流產(chǎn)、睪丸炎及關(guān)節(jié)炎等癥狀。全國的布魯氏菌病疫情形勢嚴峻，因此研究布魯氏菌及其對宿主細胞的致病機制，為布魯氏菌疫苗研發(fā)和和防控提供參考依據(jù)，對國民經(jīng)濟的發(fā)展和社會的安全具有重大的意義。

布魯氏菌毒力基因依據(jù)同源性分析，從功能上可劃分為12類，包括184個毒力基因[2]，其中較為重要的毒力因子包括表面分子、分泌/轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、調(diào)控系統(tǒng)、金屬離子獲取系統(tǒng)、氨基酸代謝系統(tǒng)、糖代謝系統(tǒng)、DNA/RNA代謝系統(tǒng)、維生素獲取因子/共棲因子、應(yīng)激蛋白/泛素、氧化還原參與分子、氮源代謝分子、暫不可分類分子、未知蛋白分子。熱休克蛋白70(DnaK)基因歸屬應(yīng)激蛋白/泛素毒力因子。目前對DnaK基因的具體功能還不清楚，為此，本研究利用同源重組方法構(gòu)建粗糙型布魯氏菌M5-90疫苗缺失株 M5-90ΔDnaK，并在細胞模型中驗證其毒力，通過小鼠模型驗證其免疫效果，為進一步研究該基因的功能和疫苗開發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料羊種布魯氏菌M5-90疫苗株、大腸桿菌E.coliDH5α克隆菌株和pUC19K質(zhì)粒均由新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室提供；人胚胎滋養(yǎng)層細胞(HPT-8)由本實驗室保存；引物Oligo由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成；pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA Maker均購自TaKaRa公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小提試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；蛋白Marker由軍事醫(yī)學科學院惠贈；IPTG購自生工生物工程(上海)有限公司；細胞因子ELISA檢測試劑盒購自美國GBD公司；小鼠布魯氏菌IgG ELISA檢測試劑盒購自RD公司；6周齡雄性BALB/c小鼠購自新疆實驗動物中心。

1.2 pMD18-T-ΔDnaK-Kana重組質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)羊種布魯氏菌標準株16MDnaK基因(29594878)上下游同源臂基因序列和pUC19K質(zhì)粒攜帶的Kan+基因序列設(shè)計相應(yīng)的引物(表1)。以布魯氏菌M5-90疫苗株的基因組為模板，以DnaK-N-F、DnaK-N-R為引物擴增DnaK基因上游同源臂(N端)；以DnaK-C-F、DnaK-C-R為引物擴增DnaK基因下游同源臂序列(C端)；以 pUC19K為模板，Kana-F、Kana-R為引物擴增Kana基因。將DnaK基因下游同源臂及Kana基因片段通過融合PCR融合后鑒定正確的融合片段由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將鑒定正確的融合片段克隆至pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-ΔDnaK-Kana。

表1 目的基因擴增的引物序列Table 1 Primers for the target gene of Brucella

1.3 布魯氏菌M5-90ΔDnaK缺失株的篩選與鑒定取500 ng同源重組質(zhì)粒 pMD18-T-ΔDnaK-Kana電轉(zhuǎn)化至 100 μL預(yù)先制備的布魯氏菌感受態(tài)細胞中[3]，轉(zhuǎn)化菌株涂布于含有卡那霉素(50 μg/mL)的TSB平板培養(yǎng)基篩選 M5-90ΔDnaK缺失株。以DnaK-F/DnaK-R為引物擴增DnaK部分基因?qū)5-90ΔDnaK進行鑒定。挑取具有卡那霉素抗性的菌落，分別劃線至卡那霉素抗性的TSB平板培養(yǎng)基和氨芐青霉素的(50 μg/mL)TSB平板培養(yǎng)基，連續(xù)純化傳代20代后，挑取只有卡那霉素抗性菌落，用上述PCR鑒定方法檢測每一代重組菌的遺傳穩(wěn)定性。

1.4 布魯氏菌生長曲線的測定將培養(yǎng)至OD600nm≈0.6的 M5-90和 M5-90ΔDnaK稀釋到 OD600nm≈0.1繼續(xù)振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每2 h取樣 25 μL，直至細菌進入平臺期，將菌液用終濃度為4%的甲醛滅活12 min，檢測其OD600nm的變化，并繪制M5-90和M5-90ΔDnaK的生長曲線。

1.5 布魯氏菌胞內(nèi)存活試驗將M5-90和M5-90ΔDnaK分別以 MOI為 100∶l比例感染 6孔板中形成單層的HPT-8細胞，37℃共孵育1.5 h，PBS洗除未感染的胞外細菌后，添加含有50 μg/mL慶大霉素的DMEM培養(yǎng)基以殺死胞外菌，PBS漂洗，更換無抗生素的細胞培養(yǎng)液，孵育0、6 h、12 h、24 h和36 h時用0.2%的TritonX-100裂解細胞，室溫放置12 min以釋放胞內(nèi)菌，對裂解液倍比稀釋，涂布固體平板，進行活菌計數(shù)，重復(fù)試驗3次。

1.6 小鼠細胞因子及抗體水平的檢測選取6周齡的BALB/c小鼠將其分為3組，每組各10只。對實驗組小鼠分別接種M5-90ΔDnaK缺失株，陽性對照組接種M5-90疫苗株，對二者均采用腹腔注射方式接種(3.0×106cfu/0.2 mL)；陰性對照組注射PBS，采集接種后7 d、14 d、28 d的小鼠血液分離血清，采用小鼠細胞因子ELISA檢測試劑盒測定小鼠血清中IFN-γ細胞因子水平，采用小鼠IgG ELISA檢測試劑盒檢測其血清中IgG抗體OD450nm值。以時間為橫坐標，細胞因子水平或者IgG抗體OD450nm值為縱坐標作圖，繪制接種M5-90和M5-90ΔDnaK后小鼠血清中IFN-γ和IgG含量曲線圖。

1.7 統(tǒng)計學分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差(±SD)描述，多組樣本間平均數(shù)用方差分析，兩組間比較采用兩樣本平均數(shù)的t參數(shù)檢驗或q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒 pMD18-T-ΔDnaK-Kana的構(gòu)建與鑒定以羊種布魯氏菌M5-90株為模板，PCR擴增其DnaK基因的上下游同源臂，結(jié)果顯示得到約1 300 bp和900 bp的基因片段(圖 1)，以pUC19K質(zhì)粒為模板利用引物Kana-F/Kana-R擴增Kana抗性基因，得到約800 bp的DNA片段，與預(yù)期一致(圖1A)，表明獲得了DnaK基因的上下游同源臂及Kana抗性基因。用融合PCR的方法將DnaK基因上、下游同源臂及Kana抗性基因融合。結(jié)果顯示，得到約3 000 bp的基因融合片段，與預(yù)期相符(圖1B)。測序后利用DANMAN軟件將融合基因與各自相應(yīng)基因進行同源性比對，結(jié)果顯示融合基因序列與DnaK上下游同源臂K1、K2和Kana抗性基因的同源性均為100%。表明獲得了DnaK上、下游同源臂及Kana抗性基因的融合片段。將獲得的融合基因片段克隆至pMD18-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18-T-ΔDnaK-Kana。利用引物Kana-F/Kana-R PCR擴增該重組質(zhì)粒Kana抗性基因并測序驗證。結(jié)果顯示，獲得約800 bp的目的條帶，與預(yù)期相符(圖1C)，表明構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD18-T-ΔDnaK-Kana。

圖1 重組質(zhì)粒 pMD18-T-ΔDnaK-Kana的構(gòu)建與鑒定Fig.1 Construction and identification of pMD18-T-ΔDnaK-Kana recombinant plasmid

2.2 缺失株M5-90ΔDnaK的構(gòu)建及遺傳穩(wěn)定性檢測將重組質(zhì)粒 pMD18-T-ΔDnaK-Kana電轉(zhuǎn)化至布魯氏菌感受態(tài)細胞中篩選獲得M5-90ΔDnaK缺失株。用DnaK-F/DnaK-R引物對布魯氏菌M5-90和M5-90ΔDnaK進行鑒定，結(jié)果顯示M5-90擴增出約600 bp的DnaK部分基因，而 M5-90ΔDnaK的擴增結(jié)果為陰性(圖2)，表明篩選到了DnaK基因缺失株。將M5-90ΔDnaK缺失株連續(xù)傳至20代，每一代用引物進行PCR檢測，結(jié)果顯示均無該600 bp的目的條帶，表明獲得能夠穩(wěn)定遺傳的M5-90ΔDnaK株。

圖2 缺失株M5-90ΔDnaK的PCR鑒定Fig.2 Identification of M5-90ΔDnaK mutant by PCR

2.3 M5-90ΔDnaK體外生長曲線測定取不同時間培養(yǎng)的 M5-90和 M5-90ΔDnaK菌液甲醛滅活后，檢測其OD600nm值，繪制二者的體外生長曲線。結(jié)果顯示，布魯氏菌M5-90和M5-90ΔDnaK的生長曲線在不同時間雖存在微小差異但總體生長趨勢一致(圖3)，大約在36 h細菌生長進入平臺期。表明DnaK基因缺失不影響M5-90的體外生長。

圖3 M5-90ΔDnaK生長曲線Fig.3 Growth curves of M5-90ΔDnaK and M5-90

2.4 M5-90ΔDnaK胞內(nèi)存活數(shù)量的檢測布魯氏菌 M5-90和 M5-90ΔDnaK以 MOI 100:l感染 HPT-8細胞，在不同的時間點對二者進行活菌計數(shù)。結(jié)果顯示，胞內(nèi)的M5-90和M5-90ΔDnaK活菌數(shù)量在感染 0和6 h時無顯著差異(p＞0.05)，而在感染 12 h、24 h和 36 h時細胞內(nèi) M5-90ΔDnaK數(shù)量顯著少于M5-90數(shù)量(p＜0.05)(圖 4)。表明缺失DnaK基因可降低布魯氏菌在HPT-8細胞內(nèi)的存活能力。

圖4 M5-90ΔDnaK胞內(nèi)存活數(shù)量檢測Fig.4 Intracellular survival number of M5-90ΔDnaK

2.5 小鼠血清細胞因子IFN-γ水平變化利用ELISA試劑盒檢測免疫后第7 d、14 d和 28 d時小鼠血清中IFN-γ含量，結(jié)果顯示，布魯氏菌M5-90組和 M5-90ΔDnaK組小鼠血清中 IFN-γ的含量隨著免疫時間的延長而增加，且二者之間無顯著差異(p＞0.05)，但均顯著高于 PBS 組(p＜0.01)(圖 5)。表明缺失DnaK基因并不影響布魯氏菌誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗布魯氏菌的細胞免疫。

圖5 免疫小鼠血清中IFN-γ水平Fig.5 The level of IFN-γ in the serum of the immunized mice

2.6 小鼠血清IgG抗體水平變化利用ELISA試劑盒檢測免疫后第7 d、14 d、28 d時小鼠血清中IgG的含量，結(jié)果顯示，布魯氏菌M5-90組和M5-90ΔDnaK組小鼠血清中IgG水平隨著免疫時間的延長而增加，且二者之間無顯著差異(p＞0.05)，但均顯著高于 PBS組(p＜0.01)(圖 6)。表明缺失DnaK基因并不影響布魯氏菌誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異的IgG抗體。

3 討論

圖6 免疫小鼠血清中IgG抗體水平Fig.6 The level of IgG in the serum of the immunized mice

目前，針對布魯氏菌病國際上多采用活疫苗免疫來防控，常用的有S19、RB51、Rev.1及S2疫苗等，但活疫苗存在一些問題；接種疫苗后產(chǎn)生的血清學反應(yīng)與感染相似，造成診斷困難等[4-5]；Rev.1疫苗帶有鏈霉素抗性基因，導(dǎo)致鏈霉素治療布魯氏菌病的效果較差[6]。M5疫苗可以為接種動物提供良好的保護力[7]，但該菌株毒力強，在小鼠體內(nèi)存活期可超過35周，并且通常會出現(xiàn)從光滑型到粗糙型的變異，它是我國目前使用的疫苗中毒力最強的菌株[8]。因此，本研究所將M5在雞成纖維細胞傳 90代，培育出M5-90疫苗株。該菌株毒力相對降低，具有良好的免疫原性。但M5-90也有缺點[3]：疫苗免疫可導(dǎo)致部分懷孕母畜流產(chǎn)，因此仍需對M5-90疫苗進行改造。本研究構(gòu)建的布魯氏菌基因缺失株M5-90ΔDnaK在HPT-8細胞內(nèi)的存活能力明顯下降；接種小鼠后，其血清能夠產(chǎn)生與M5-90相似的免疫反應(yīng)，為布魯氏菌病的防治和該菌致懷孕母畜流產(chǎn)的分子機制提供了新思路。

熱休克蛋白主要包括HSP110、HSP90、HSP70、HSP60等分子[9-10]。HSP70家族是熱休克蛋白抗病原微生物中免疫反應(yīng)的重要調(diào)控子[11]。其在原核細胞中被稱為DnaK，它的免疫優(yōu)勢與其特性和功能可能有關(guān)。DnaK在不同細菌種屬間的序列高度保守，當機體受到細菌感染時，之前感染的病原微生物產(chǎn)生的記憶細胞能夠識別其保守序列[12]。正常情況下DnaK在細菌體內(nèi)的表達水平低，但卻在正常的細胞生理活動中發(fā)揮關(guān)鍵作用。當細菌遇到惡劣環(huán)境的刺激，細胞內(nèi)的蛋白合成翻譯受到抑制，誘導(dǎo)其合成大量的DnaK并在數(shù)分鐘內(nèi)達到最高，因此增加了細菌的抗應(yīng)激能力[13]。DnaK是在細菌的抗熱應(yīng)激、抗氧化應(yīng)激、抗酸堿應(yīng)激中發(fā)揮保護功能的毒力因子，還調(diào)控其它一些毒力因子的表達水平[14]。本研究結(jié)果顯示，DnaK基因缺失不影響M5-90的體外生長，并且可降低其在HPT-8細胞內(nèi)的存活能力。由于HPT-8細胞是布魯氏菌侵染的靶細胞，HPT-8細胞受損傷是引起母畜流產(chǎn)的重要原因，因此DnaK基因缺失可以降低布魯氏菌導(dǎo)致的HPT-8細胞的損傷。因此DnaK基因可能與M5-90導(dǎo)致懷孕母畜流產(chǎn)有關(guān)。INF-γ是抗布魯氏菌免疫反應(yīng)中關(guān)鍵性的細胞因子[15]，主要由活化后的NK細胞、CD4+T和CD8+T細胞產(chǎn)生。血清中的抗體在抗布魯氏菌感染的過程中起著重要的作用，抗體的滴度與機體抗布魯氏菌的抵抗呈正相關(guān)，因此檢測血清中特異性IgG抗體水平也是評價布魯氏菌疫苗免疫原性的一個重要指標[16]。本研究顯示缺失株M5-90ΔDnaK與親本株M5-90誘導(dǎo)機體產(chǎn)生的INF-γ和IgG增長趨勢相似，并且隨著免疫時間的延長均呈上升趨勢，表明布魯氏菌缺失株M5-90ΔDnaK可使宿主產(chǎn)生良好的細胞免疫和體液免疫反應(yīng)，進一步表明M5-90ΔDnaK可作為預(yù)防布魯氏菌的候選疫苗。

綜上所述，本研究顯示DnaK基因缺失不影響布魯氏菌菌落生長速度和小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)，顯著降低了其在HPT-8細胞內(nèi)的復(fù)制能力，表明DnaK基因在布魯氏菌中起著重要調(diào)控作用，為探究DnaK在布魯氏菌中的功能和疫苗研制奠定了基礎(chǔ)。