尼美舒利原料藥含量的2種測定方法的比較

羅 誠，陳 莉，朱躍芳

尼美舒利是一種非甾體抗炎藥，能選擇性地抑制環(huán)氧化酶COX2，在發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛消炎作用的同時，減少了消化性潰瘍等非甾體抗炎藥物常見的不良反應(yīng)。臨床上常用于慢性關(guān)節(jié)炎、術(shù)后或急性創(chuàng)傷后疼痛、急性上呼吸道感染等疾病的治療［1，2］。 尼美舒利分子中含磺酰胺結(jié)構(gòu)，具有弱酸性，《中國藥典》2015年版二部采用電位滴定法，以氫氧化鈉滴定液測定尼美舒利原料藥的含量［3］。其他文獻(xiàn)中，尼美舒利制劑的含量測定以及血藥濃度監(jiān)測常采用高效液相色譜法、紫外分光光度法、薄層掃描法等［4-6］，少有以高效液相色譜法測定尼美舒利原料藥含量的報道。

筆者采用高效液相色譜法測定尼美舒利原料藥的含量，并與《中國藥典》2015年版二部中的電位滴定法進行比較，現(xiàn)報告如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Agilent TC-C18色譜柱（250.0mm×4.6mm，5μm）、Inertsil ODS-3 色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）、資生堂 CAPCELL PAK C18色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters XTerra C18色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；916 Ti-Touch 自動電位滴定儀（瑞士萬通公司）；888 Titrino自動電位滴定儀（瑞士萬通公司）；ZDJ-3D全自動電位滴定儀 （北京先驅(qū)星科技發(fā)展有限公司）；848 Titrino plus自動電位滴定儀（瑞士萬通公司）；AG-135電子分析天平（梅特勒-托利多）。

尼美舒利對照品 （批號100555-201202，含量100.0%，中國食品藥品檢定研究院）；尼美舒利原料藥（批號 141182、141183，以下分別用 1#、2# 代替，天津藥物研究院藥業(yè)）；丙酮（批號200808、201012，分析純，中國醫(yī)藥集團上海化學(xué)試劑公司）、丙酮（批號201205、201307，色譜純，天津市化學(xué)試劑研究所），磷酸、氨水均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜法

2.1.1 色譜條件 采用Agilent TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相為 0.1%磷酸溶液（用氨水調(diào) pH 至 7.0）-乙腈 （60∶40）； 流速 1.0 ml/min，檢測波長 393 nm，進樣量 10 μl。

2.1.2 溶液的配制 對照品溶液的配制：精密稱取經(jīng)105℃干燥2 h的尼美舒利對照品約20 mg，置100 ml量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，得對照品儲備液，精密量取對照品儲備液10 ml置20 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得到濃度約為100 μg/ml的對照品溶液。同法制備供試品溶液。

2.1.3 專屬性試驗 取2.1.2項下制備的對照品溶液和供試品溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖和光譜圖。圖1～4表明，供試品和對照品在該色譜條件下出峰時間吻合，峰型良好，光譜圖一致，說明該方法專屬性良好。

圖1 對照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

圖3 對照品光譜圖

2.1.4 線性范圍考察 精密量取2.1.2項下的對照品儲備溶液適量，用流動相稀釋成濃度為10、40、80、120、160、200 μg/ml的梯度對照品溶液。 精密量取各梯度對照品溶液10 μl，注入液相色譜儀，以尼美舒利濃度為橫坐標(biāo)（X），色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行回歸分析，得到回歸方程為：Y=21.109X-1.583，r=1.000，說明尼美舒利在 10.00～200 μg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗 取同一供試品溶液（批號1#），按2.1.1項下的方法連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，色譜峰面積RSD（n=6）為0.2%，說明儀器精密度良好。

圖4 供試品光譜圖

2.1.6 重復(fù)性試驗 取同一批尼美舒利原料藥（批號1#），按2.1.2項下的方法制備供試品溶液共6份，進行平行測定，結(jié)果6次測定的平均含量為99.73%，RSD（n=6）為 0.2%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，在室溫下放置 0、2、4、6、12、24 h 后進樣， 記錄色譜峰面積，RSD（n=6）為 0.4%，說明供試品溶液在 24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收率試驗 將供試品（批號1#，含量99.73%）稱樣量減半，共稱取9份，分成3組，每組分別加入相當(dāng)于供試品80%、100%、120%的尼美舒利對照品，配制成供試品溶液。按2.1.1的條件進行測定，計算加樣回收率，結(jié)果9份供試品加樣回收率為98.61%～100.61%，平均加樣回收率為99.52%，RSD（n=9）為 0.7%。 見表 1。

表1 HPLC法加樣回收率測定結(jié)果

2.1.9 方法耐用性考察 采用同一批尼美舒利原料藥（批號 1#），按 2．1．2 項下的方法制備供試品溶液，分別使用Agilent TC－C18色譜柱 （250 mm×4．6 mm，5 μm）、Inertsil ODS－3 色譜柱 （250 mm×4．6 mm，5 μm）、 資生堂 CAPCELL PAK C18色譜柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）、Waters XTerra C18色譜柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）測定供試品含量，結(jié)果含量分別為 99．73%、100．12%、99．79%、99．68%，RSD 為0．2%。將上述供試品溶液，采用 Agilent TC－C18色譜柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）， 在柱溫為 25 ℃、30 ℃、35℃、40℃下分別進樣，計算含量，結(jié)果分別為99．80%、99．92%、100．06%、99．71%，RSD 為 0．2%。改變流動相 pH 值為 6．8、7．0、7．2 測定供試品含量，每個pH值下各平行測定兩次，結(jié)果主峰拖尾因子均＜2， 含量分別為 99．87%、99．75%、99．89%、100．00%、100．03%、99．51%，RSD 為 0．2%。 改變流動相比例為（55∶45）、（60∶40）、（65∶35）測定供試品含量，每個條件下各平行測定兩次，結(jié)果主峰與各雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，拖尾因子均＜2，含量分別為 99．96%、99．77%、99．90%、100．15%、99．74%、100．04%，RSD 為 0．2%。說明該方法耐用性良好。

2.2 電位滴定法

2.2.1 電位滴定參數(shù) 樣品滴定參數(shù)：采用DET動態(tài)滴定模式，等當(dāng)點判據(jù)標(biāo)準(zhǔn)30 mV，信號漂移20 mV/min，等當(dāng)點后體積 1．0 ml?？瞻椎味▍?shù)：采用MET等量滴定模式，等當(dāng)點判據(jù)標(biāo)準(zhǔn)5 mV，滴定液增量 0．005 ml/min，信號漂移 10 mV/min，等當(dāng)點后體積 0．5 ml。

2.2.2 測定方法［3］精密稱取尼美舒利原料藥約0．25 g，加中性丙酮（對酚酞指示液顯中性）40 ml使其溶解，加水20 ml，照電位滴定法（《中國藥典》2015年版四部通則 0701），用氫氧化鈉滴定液（0．1 mol/L）滴定，并將結(jié)果用空白試驗校正。每1 ml氫氧化鈉滴定液（0．1 mol/L）相當(dāng)于 30．83 mg 的 C13H12N2O5S。

2.2.3 重復(fù)性試驗 取同一批尼美舒利原料藥（批號 1#），精密稱取 6 份，按 2．2．2 的方法在 916 Ti－Touch自動電位滴定儀上測定，得到平均含量為100．04%，RSD（n=6）為 0．5%。

2.2.4 加樣回收率試驗 取已知含量的同一批尼美舒利原料藥（批號 1#，含量 100．04%），按 2．2．2 項下的方法稱取供試品6份，供試品取樣量減半，加入相當(dāng)于供試品100%的對照品后，在916 Ti－Touch自動電位滴定儀上測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 電位滴定法加樣回收率測定結(jié)果

2.2.5 中性丙酮的考察 在調(diào)制中性丙酮（對酚酞指示液顯中性）時發(fā)現(xiàn)，酚酞在丙酮中顯色不明顯，終點難以判斷。若滴加的氫氧化鈉滴定液過量，多余的氫氧化鈉會與尼美舒利反應(yīng)造成結(jié)果偏低。該次實驗考察了中性丙酮（顯微紅）、中性丙酮（稍顯微紅）及不調(diào)中性丙酮對結(jié)果的影響，結(jié)果見表3?？梢钥闯觯?dāng)電位滴定參數(shù)設(shè)置合理時，由于空白已扣除，丙酮是否調(diào)中性對結(jié)果幾乎無影響，但調(diào)過頭會導(dǎo)致結(jié)果偏低。由于空白滴定突躍不明顯，應(yīng)適當(dāng)將“等當(dāng)點后體積”適當(dāng)設(shè)大，以防出現(xiàn)偽終點。

表3 中性丙酮考察結(jié)果

2.2.6 方法耐用性考察 采用同一批尼美舒利原料藥（批號 1#），按 2．2．2 項下的方法制備供試品溶液，分別使用916 Ti－Touch自動電位滴定儀（瑞士萬通公司）、888 Titrino自動電位滴定儀（瑞士萬通公司）、848 Titrino plus自動電位滴定儀（瑞士萬通公司）、ZDJ-3D全自動電位滴定儀 （北京先驅(qū)星科技發(fā)展有限公司）測定供試品含量，結(jié)果含量分別為100.04%、100.53%、99.68%、99.62%，RSD為0.5%；分別使用兩廠家共四批次的丙酮 （分析純和色譜純各兩批）作為溶劑，按2.2.2項下的方法測定，結(jié)果分別為 100.26%、99.57%、99.83%、100.37%，RSD為0.4%；分別使用4份不同人員調(diào)制的中性丙酮作為溶劑，按2.2.2項下的方法測定，結(jié)果分別為100.07%、99.43%、99.78%、100.28%，RSD 為 0.4%。

2.3 兩種方法測定結(jié)果比較［7］取兩批尼美舒利原料藥（批號1#，2#），用高效液相色譜法和電位滴定法分別測定含量，結(jié)果如表4所示。將兩組結(jié)果進行F檢驗，得到在95%置信水平上兩批樣品F值均小于F臨界值，說明兩種方法在精密度上無明顯差異。進而用t檢驗分析，結(jié)果兩批樣品t值分別為2.141 和 1.460，均小于臨界值 （t0.05/2，5=2.571），表明兩種方法測得的尼美舒利含量無統(tǒng)計學(xué)差異 （P>0.05）。

表4 兩種方法測定結(jié)果比較

3 討論

3.1 高效液相色譜法 雖然中國、英國等多國藥典常采用滴定法測原料藥的含量，ICH（international councilpor harmonization，人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會）也認(rèn)可容量法［8，9］，但與容量法相比，HPLC法具有專屬性強、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、取樣量少和方便大批量分析等優(yōu)點。特別是當(dāng)原料藥中存在雜質(zhì)或儲存期降解產(chǎn)生雜質(zhì)，對滴定造成潛在干擾時，HPLC法更顯示出獨特的優(yōu)勢。通過對兩批尼美舒利原料進行測定，發(fā)現(xiàn)HPLC法和電位滴定法測定結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，但HPLC法專屬性更強、重復(fù)性及耐用性更佳。

3.2 電位滴定法 電位滴定法是容量法中的一種，具有操作簡便、分析時間短、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點［10］。2017年中國食品藥品檢定研究院發(fā)起了《尼美舒利含量測定能力驗證》，檢驗方法是電位滴定法，參與此次能力驗證的實驗室為141家，取得滿意結(jié)果的為 109家［11］，通過率 77.30%，低于同年其他項目通過率的平均值，提示該方法可能耐用性較差。該文研究發(fā)現(xiàn)，用電位滴定法測定尼美舒利含量時應(yīng)注意兩點：一是滴定參數(shù)的設(shè)置?？瞻椎味☉?yīng)設(shè)置成MET等量滴定模式，將滴定液增量設(shè)置成最小，以防過量，同時應(yīng)適當(dāng)調(diào)高等當(dāng)點后體積，以防止得到的是偽終點。二是中性丙酮的配制。方法中使用到中性丙酮 （對酚酞指示液顯中性），該次研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)味▍?shù)設(shè)置合理時，丙酮是否調(diào)中性對測定結(jié)果沒有影響，但由于調(diào)中性時丙酮變色不明顯，容易調(diào)過頭導(dǎo)致結(jié)果偏低。

兩種方法均可用于尼美舒利原料藥的質(zhì)量控制，各有優(yōu)勢，采用電位滴定法時應(yīng)注意參數(shù)的設(shè)置以及中性丙酮的配制。