2例西弗射盾子囊霉的分離與鑒定

陳菲 周萬(wàn)青 張之烽

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京 210008)

西弗射盾子囊霉 (Stephanoascusciferrii)，又稱西弗念珠菌 (Candidaciferrii)，是一種少見的條件致病性真菌[1]。由于抗生素、免疫抑制劑、激素的廣泛應(yīng)用，致使條件致病菌的感染機(jī)會(huì)增多，真菌病原譜也發(fā)生了很大變化，給臨床診斷和治療增加了難度。近年來(lái)，西弗射盾子囊霉在痰液、腦脊液、腹膜透析液、耳道分泌物、血液中均有分離成功的報(bào)道[1-5]。本文對(duì)2例西弗射盾子囊霉感染病例進(jìn)行介紹，從形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性及分子生物學(xué)等方面來(lái)說(shuō)明檢驗(yàn)技術(shù)對(duì)臨床少見病原菌菌種鑒定和治療的重要性。

1 材料及方法

1.1 病例資料

患者1，女，51歲，雙耳間斷性流膿數(shù)年，伴聽力下降，常發(fā)生于感冒后。患者于1周前癥狀加重，于2017年6月21日來(lái)我院就診并以“雙側(cè)慢性化膿性中耳炎”收入院。入院后專科檢查見雙側(cè)鼓膜緊張部穿孔，鼓室內(nèi)見少量膿性分泌物；聽力檢查示雙側(cè)中度傳導(dǎo)性聽力下降。實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)、生化、凝血未見異常，送檢雙份耳分泌物培養(yǎng)，均檢出西弗射盾子囊霉。6月25日在全麻下行“左鼓室成形術(shù)+外耳道成形術(shù)+后上鼓室探查”手術(shù)同時(shí)予氟康唑抗感染，術(shù)后切口愈合好，無(wú)紅腫滲出，準(zhǔn)予術(shù)后1周出院。術(shù)后3個(gè)月隨訪未見異常。

患者2，男，59歲，因“肝移植術(shù)后1年余，反復(fù)膚黃尿黃眼黃伴發(fā)熱7個(gè)月” 于2017年11月21日入院?；颊呒韧蛟l(fā)性膽汁性肝硬化導(dǎo)致肝衰竭行肝移植術(shù)、肝內(nèi)膽管結(jié)石行PTCD術(shù)、經(jīng)皮腎鏡碎石取石術(shù)+經(jīng)皮膽道取石術(shù)，另有腰椎陳舊性骨折、陳舊性腔隙性腦梗死等基礎(chǔ)疾病。入院查體：體溫38.9 ℃，脈搏112次/min，呼吸27次/min，血壓135/87 mmHg，皮膚鞏膜黃染，腹軟，無(wú)壓痛反跳痛。實(shí)驗(yàn)室檢查：WBC 3.1×109/L，Neu 60%，Hb 62 g/L，C反應(yīng)蛋白104.3 mg/L。腹部CT示肝內(nèi)膽管結(jié)石，肝內(nèi)包裹性積液；心臟超聲示左心舒張功能減退。T管引流膽汁培養(yǎng)檢出肺炎克雷伯菌與西弗射盾子囊霉。真菌葡聚糖495 pg/mL，真菌GM試驗(yàn)陰性。臨床行比阿陪南+氟康唑抗感染治療，培菲康調(diào)理腸道。2 d后患者熱峰較入院時(shí)下降 (38.1℃)，提示抗感染治療有效。但由于患者長(zhǎng)期服用免疫抑制劑，基礎(chǔ)免疫力極低，感染未完全糾正，反復(fù)發(fā)熱，血鉀仍在較低水平，并于12月6日出現(xiàn)呼吸、心率、血氧飽和度下降，搶救無(wú)效死亡。

1.2 試劑與儀器

Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套YST鑒定卡、ATB FUNGUS 3真菌藥敏檢測(cè)條、哥倫比亞血瓊脂平板 (法國(guó)梅里埃公司)；科瑪嘉顯色平板、沙保弱斜面培養(yǎng)基 (鄭州博賽)；營(yíng)養(yǎng)肉湯 (上?？片敿喂?；DNA提取試劑盒 (Qiagen)；PCR試劑 (上海生工公司)；引物及序列測(cè)定由上海生工公司完成。

1.3 細(xì)菌培養(yǎng)與鑒定

對(duì)于病例1，將耳分泌物標(biāo)本直接接種哥倫比亞血平板，培養(yǎng)24 h后菌落涂片為真菌，轉(zhuǎn)種科瑪嘉顯色平板以及沙保弱斜面培養(yǎng)基，分別置于35℃及28℃培養(yǎng)，24 h后連續(xù)觀察菌落形態(tài)。經(jīng)革蘭染色后觀察菌體形態(tài)。Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套YST鑒定卡進(jìn)行鑒定。

對(duì)于病例2，將膽汁標(biāo)本置肉湯增菌24 h后轉(zhuǎn)種哥倫比亞血平板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后菌落涂片為真菌，轉(zhuǎn)種科瑪嘉顯色平板以及沙保弱斜面培養(yǎng)基，分別置于35℃及28℃培養(yǎng)，24 h后連續(xù)觀察菌落形態(tài)。經(jīng)革蘭染色后觀察菌體形態(tài)。Vitek 2 Compact全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及配套的YST鑒定卡進(jìn)行鑒定。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

采用德國(guó)Qiagen試劑盒提取菌株DNA。參照文獻(xiàn)[6]對(duì)真菌ITS1、ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR體系為50 μL：2×Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，無(wú)菌蒸餾水21 μL。反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)進(jìn)行。陽(yáng)性產(chǎn)物委托上海生工公司進(jìn)行雙向測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果經(jīng)PubMed進(jìn)行Blast比對(duì)。

1.4 藥敏試驗(yàn)

采用ATB FUNGUS 3真菌藥敏檢測(cè)條進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，35℃孵育24 h后讀取結(jié)果，具體參見試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 菌落特征

2株菌株在哥倫比亞血瓊脂平板、科瑪嘉顯色平板和沙保弱斜面培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，且菌落形態(tài)相似?？片敿物@色平板上菌落特點(diǎn)：24 h菌落為無(wú)色，針尖狀，接種環(huán)不易刮起，生理鹽水中不易研磨；48 h后菌落稍大，逐漸顯藍(lán)綠色，72 h后菌落為藍(lán)綠色，開始粗糙，凸出平板生長(zhǎng)，1周后菌落呈規(guī)則圓形，灰藍(lán)色，菌落中心明顯凹陷 (見圖1a)。

2.2 鏡下特征

科瑪嘉顯色平板上培養(yǎng)24 h后涂片，革蘭染色見菌絲，樹枝狀 (見圖1b)；1周后取菌落涂片，見大量菌絲孢子，孢子沿菌絲周邊分布 (見圖1c)。

圖1西弗射盾子囊霉培養(yǎng)菌落及革蘭染色結(jié)果：a.科瑪嘉顯色平板35℃培養(yǎng)1周；b.科瑪嘉顯色平板35℃培養(yǎng)24 h革蘭染色 (×1 000)；c.科瑪嘉顯色平板35℃培養(yǎng)1周革蘭染色 (×1 000)

Fig.1The colonial morphology and Gram staining results ofStephanoascusciferrii: a. Colonial morphology on CHROM agar at 35℃ for 1 week; b. Gram staining ofStephanoascusciferriiat 35℃ for 24 h (×1 000); c. Gram staining ofStephanoascusciferriiat 35℃ for 1 week (×1 000)

2.3 生化鑒定

Vitek 2 Compact配套YST酵母菌鑒定卡鑒定結(jié)果為西弗射盾子囊霉，生物編碼分別為6713567572777771，6713167572777571，可信度分別為97%與95%，重復(fù)鑒定結(jié)果一致。

2.4 分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)ITS測(cè)序及PubMed上Blast比對(duì)，2株菌序列與Trichomonascusciferrii(序列號(hào):LC158132.1)同源性均為100%。

2.5 體外藥敏結(jié)果

經(jīng)ATB FUNGUS 3真菌藥敏檢測(cè)，2菌株體外最低抑菌濃度 (MIC)分別為：5-氟胞嘧啶≤4 μg/mL、兩性霉素 B≤0.5 μg/mL、氟康唑≤1 μg/mL、伊曲康唑≤0.125 μg/mL、伏立康唑≤0.06 μg/mL。

3 討 論

子囊菌隸屬于真菌界 (Fungi)、子囊菌門 (Asco-mycota)、酵母綱 (Saccharomycetes)、酵母目 (Saccha-romycetales)、酵母菌科 (saccharomycetales)、子囊菌屬 (Stephanoascus)[7]，西弗射盾子囊霉與孢子絲菌屬和念珠菌屬同源，但在形態(tài)特征差別較大，可通過有性繁殖在子囊中產(chǎn)生子囊孢子[8]。該菌是一種較為少見的條件致病菌，可在宿主免疫功能低下時(shí)導(dǎo)致感染[9]。本文2例患者，患者1常在感冒時(shí)出現(xiàn)雙耳流膿；而患者2由于肝移植術(shù)后長(zhǎng)期服用免疫抑制劑，機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)，繼發(fā)膽道感染，由于患者基礎(chǔ)免疫力極低，臨床抗感染治療效果不佳。

由于西弗射盾子囊霉較為少見，對(duì)該菌的鑒定尤為重要。該菌在血平板、沙保弱培養(yǎng)基等臨床常用培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，在科瑪嘉顯色平板上為灰藍(lán)色凸起菌落，邊緣整齊，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落會(huì)出現(xiàn)凹陷，鑲嵌于平板中，不易刮起，不易研磨。革蘭染色涂片，可見菌絲，真菌孢子呈卵圓形沿菌絲排列。但僅僅靠上述特征進(jìn)行鑒定較為困難。傳統(tǒng)的真菌分類方法主要根據(jù)真菌的形態(tài)學(xué)、生理生化特點(diǎn)及生理生化指標(biāo)來(lái)進(jìn)行分析，但由于某些真菌屬、種之間的形態(tài)學(xué)或生理生化差異極不顯著，且真菌的培養(yǎng)和檢出需要特殊培養(yǎng)條件和方法以及多數(shù)真菌的生長(zhǎng)緩慢等特點(diǎn)的影響，給真菌鑒定工作帶來(lái)困難[10]。分子生物學(xué)技術(shù)具有快速、靈敏、特異性高的特點(diǎn)，已被廣泛運(yùn)用于臨床感染的診斷中，包括深部真菌感染的早期診斷。目前, 這些分子生物學(xué)檢測(cè)方法多聚焦于對(duì)rDNA的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (internaltranscribedspacer,ITS)序列分析的研究，rDNA-ITS由于不加入成熟核糖體，所以受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速率較快，具有廣泛的序列多態(tài)性，在其保守性上表現(xiàn)為在種內(nèi)不同菌株之間高度保守，而在真菌種間差異明顯，這種特點(diǎn)使得ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析[11]。在臨床檢驗(yàn)工作中，不僅要熟練掌握基本的檢驗(yàn)技術(shù)，如涂片鏡檢及觀察菌落特點(diǎn)，更要學(xué)會(huì)將傳統(tǒng)的培養(yǎng)法與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，提高檢驗(yàn)水平，早期快速、準(zhǔn)確可靠地幫助臨床診斷。

本文分離菌株藥敏結(jié)果顯示5-氟胞嘧啶、兩性霉素B、氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑均敏感。國(guó)外有分離出對(duì)抗真菌藥物氟康唑耐藥的菌株[12]。由于ATB FUNGUS 3真菌藥敏檢測(cè)條推薦用于念珠菌與隱球菌藥敏測(cè)試，用于西弗射盾子囊霉還有待進(jìn)一步研究[1]。