多位點(diǎn)序列分型技術(shù)在熱帶念珠菌中的應(yīng)用研究

王影 項(xiàng)明潔 劉錦燕 葉書(shū)來(lái) 周馨

(1.中國(guó)科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230001；2.上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200025；3.上海交通大學(xué)附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院放免檢驗(yàn)科，上海 200020)

念珠菌是一類(lèi)條件致病性真菌，是目前臨床上真菌感染的主要致病菌，常見(jiàn)的有白念珠菌、熱帶念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌等[1-2]。近年來(lái)，隨著廣譜抗生素和免疫抑制劑的使用，使得念珠菌的感染率日漸上升[3]。雖然在臨床念珠菌的感染中白念珠菌最常見(jiàn)，但是由非白念珠菌類(lèi)菌株引起的感染，其發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，其中以熱帶念珠菌較常見(jiàn)[4]。國(guó)內(nèi)的一些研究顯示，熱帶念珠菌分離率已成為非白念珠菌中第二位或者第三位[5-7]。

分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于鑒定念珠菌基因型別以及菌株間致病相關(guān)性的研究，其中，基因分型是一種重要的微生物流行病學(xué)研究工具[8-9]，而MLST分型技術(shù)是目前公認(rèn)的最有權(quán)威的分型方法。Arianna等[10]已在2005年建立了熱帶念珠菌MLST分型數(shù)據(jù)庫(kù) (https://pubmlst.org/ctropicalis/)。熱帶念珠菌MLST分型是基于對(duì)其6對(duì)管家基因的單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphisms，SNPs)的分析，這6對(duì)管家基因分別是ICL1,MDR1,SAPT2,SAPT4,XYR1和ZWF1a。通過(guò)基因PCR擴(kuò)散、測(cè)序得到臨床菌株各管家基因的序列，與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到每個(gè)管家基因的等位基因號(hào)，再根據(jù)6個(gè)管家基因的基因號(hào)的組合得到每個(gè)菌株的二倍體序列型DST。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)熱帶念珠菌MLST型別的研究較少，此次研究旨在探究本地區(qū)臨床菌株的優(yōu)勢(shì)MLST型別。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株來(lái)源 本研究所用的的92株臨床熱帶念珠菌均來(lái)自于上海市瑞金醫(yī)院自2012～2015年的住院及門(mén)急診的71名患者 (53名男性，18名女性)。其中，41株臨床菌株來(lái)自于無(wú)菌體液 (中段尿30株、血液4株、膽汁2株、引流液2株、導(dǎo)管2株、穿刺液1株)，其余標(biāo)本來(lái)自痰液33株、咽拭子4株、糞便7株、膿液1株、創(chuàng)面2株、肛周3株、分泌物1株。

儀器與試劑 API微生物鑒定系統(tǒng) (法國(guó)梅里埃公司)；PCR儀 (S100TMThermal Cycler PCR，Bio-Rad美國(guó))；Tanon EPS-300水平式電泳儀和Tanon凝膠成像系統(tǒng) (上海天能科技有限公司)；YPD培養(yǎng)基 (上海博微生物科技有限公司)；Ex Taq酶 (TaKaRa公司)；DNA Marker DL2000 (TaKaRa公司)；MLST引物由生工生物工程 (上海)有限公司進(jìn)行合成。

1.2 方法

菌株鑒定 將于-80℃ 25%甘油凍存的菌株標(biāo)本接種于科瑪嘉酵母菌顯色平板，于35℃培養(yǎng)24～48 h后，熱帶念珠菌呈深藍(lán)綠色。再用API 20C AUX酵母菌鑒定系統(tǒng)對(duì)臨床分離的菌株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。將最終鑒定成功的菌落取單克隆增菌培養(yǎng)后，置于-80℃ 25%甘油培養(yǎng)液中凍存待用。

藥敏鑒定 以白念珠菌ATCC 90028為陰性對(duì)照，克柔念珠菌ATCC 6258為陽(yáng)性對(duì)照，采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)菌株的最低抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration，MIC)。具體檢測(cè)方法按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) (the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M27-A3方案進(jìn)行。

DNA提取 熱帶念珠菌經(jīng)YPD培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)過(guò)夜，收集菌體，加酵母菌裂解液 (10%SDS、0.5 mmol/L pH 8.0 EDTA和蛋白酶K)后，65℃水浴2 h破壁，用苯酚、氯仿、異戊醇 (25∶24∶1)和氯仿各抽提1次，異丙醇沉淀，后用75%乙醇洗滌，加水溶解，-20℃凍存。

MLST基因分型檢測(cè) 根據(jù)熱帶念珠菌MLST分型數(shù)據(jù)庫(kù) (https://pubmlst.org/ctropicalis/)及Arianna等的報(bào)道，選取熱帶念珠菌的6對(duì)管家基因，分別是ICL1,MDR1,SAPT2,SAPT4,XYR1和ZWF1a，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)合成相應(yīng)的引物序列，具體見(jiàn)表1。利用合成后的引物擴(kuò)增臨床菌株各管家基因片段，PCR反應(yīng)體系包括Ex Taq酶0.25 μL，10×Ex buffer 5 μL (含20 mmol/L Mg2+)，dNTPs 4 μL，50 μmol/L的正向和反向引物各0.4 μL，DNA模板 (200 ng/μL)1 μL和雙蒸水ddH2O 38.95 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 1 min,共29個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與6×loading buffer混勻后加入1.5%瓊脂糖凝膠電泳孔，在Tanon EPS-300水平式電泳儀中電泳20 min，經(jīng)Tanon凝膠成像系統(tǒng)證實(shí)為單一條帶后，送生工生物工程 (上海)有限公司測(cè)序，測(cè)序引物與擴(kuò)增引物相同，測(cè)序方法為sanger法，由于熱帶念珠菌為二倍體菌株，所有基因測(cè)序均采用正反雙向引物同時(shí)測(cè)序。

表1 MLST擴(kuò)增及測(cè)序引物

數(shù)據(jù)分析 利用Chromas 2.22軟件處理熱帶念珠菌各管家基因測(cè)序結(jié)果。由于熱帶念珠菌是二倍體菌株，對(duì)于測(cè)序的雜合子位點(diǎn)，根據(jù)理論與應(yīng)用化學(xué)國(guó)際聯(lián)合會(huì) (International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC)的標(biāo)準(zhǔn)，C/T雜合、A/T雜合、G/T雜合、A/G雜合和C/G雜合分別用Y、W、K、R和S表示。整理后的測(cè)序結(jié)果與熱帶念珠菌MLST分型數(shù)據(jù)庫(kù) (https://pubmlst.org/ctropicalis/)比對(duì)，得到各菌株各管家基因的型號(hào)，將6個(gè)管家基因的型號(hào)組合即可得到每個(gè)菌株的MLST型號(hào)，將本研究中新得到的MLST型別上傳至熱帶念珠菌MLST分型數(shù)據(jù)庫(kù)。利用eBURST V3軟件對(duì)臨床熱帶念珠菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)繪制 利用MEGA 6.0軟件，基于菌株MLST型別采用非加權(quán)組平均法 (unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并對(duì)構(gòu)建樹(shù)進(jìn)行自檢 (Bootstrap)，重復(fù)次數(shù)設(shè)定為1 000次。

2 結(jié) 果

對(duì)臨床92株熱帶念珠菌進(jìn)行MLST分型，得到12種新的管家基因型別，47種DSTs型別。在47種DSTs型別中32種為新型，已將32種新型上傳至熱帶念珠菌MLST數(shù)據(jù)庫(kù)并得到審核。用eBURSTV3軟件對(duì)臨床熱帶念珠菌的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，得到7個(gè)克隆簇，見(jiàn)圖1，克隆簇1包含5種DSTs (503、504、341、346和519)、克隆簇2包含4種DSTs (507、505、506和376)、克隆簇3包含3種DSTs (516、526和525)、克隆簇4包含3種DSTs (337、522和149)、克隆簇5包含3種DSTs (331、443和394)、克隆簇6包含2種DSTs (520和514)、克隆簇7包含2種DSTs (333和532)。在47種DSTs中，有2種優(yōu)勢(shì)型別DST507和DST376，分別包含16株菌和11株臨床菌株，占17.39%和11.96%，經(jīng)eBURSTV3軟件分析這兩種DSTs屬于同一種克隆簇。MEGA 6.0軟件建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖2所示，其建樹(shù)結(jié)果與eBURSTV3分析結(jié)果稍有差異，但主要的克隆簇1和克隆簇2結(jié)果一致。

圖1eBURSTV3軟件分析結(jié)果：分為7個(gè)克隆簇和25個(gè)單個(gè)MLST型別

Fig.1The analysis result of eBURST V3:including 7 clonal clusters and 25 singletons

對(duì)基因型別為DST507和DST376的的27株臨床菌株及其他6株屬于單個(gè)MLST型別的菌株進(jìn)行藥敏檢測(cè)，根據(jù)熱帶念珠菌對(duì)氟康唑，伊曲康唑和伏立康唑的耐藥折點(diǎn)分別為≥8 mg/L, ≥1 mg/L及≥1 mg/L，結(jié)果顯示6株屬于單個(gè)MLST型別的菌株僅1株對(duì)至少一種藥物耐藥，耐藥率為16.67%；而屬于優(yōu)勢(shì)型別的27株臨床菌株中有21株對(duì)至少一種藥物耐藥，耐藥率為77.78%，其中有部分菌株來(lái)源于同一個(gè)患者，見(jiàn)表2。

圖2 基于MLST型別的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

3 討 論

熱帶念珠菌作為一種條件致病性真菌，正常情況下可定植于人體，如皮膚、呼吸系統(tǒng)、胃腸系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)等，但當(dāng)患者免疫力低下時(shí)，可引起嚴(yán)重的系統(tǒng)性感染。研究表明，長(zhǎng)期中性粒細(xì)胞減少癥、惡性血液腫瘤以及接受骨髓移植是熱帶念珠菌感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4,6]，而由念珠菌引起的尿液或血流感染中，熱帶念珠菌占第一或者第二位[11]。由于抗真菌藥物的廣泛使用，熱帶念珠菌的耐藥現(xiàn)象已成為臨床治療中的問(wèn)題，Pfaller等[12]的研究稱(chēng)熱帶念珠菌對(duì)氟康唑和伏立康唑的耐藥率高于白念珠菌。已有研究發(fā)現(xiàn)對(duì)棘白菌素類(lèi) (如卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈)抗真菌藥耐藥的臨床熱帶念珠菌[13-15]。與白念珠菌類(lèi)似，熱帶念珠菌耐藥機(jī)制主要表現(xiàn)為：菌株細(xì)胞膜上藥物相關(guān)外排泵表達(dá)過(guò)度[16]，如CDR1、CDR2、MDR1及SNQ2；藥物作用靶酶的改變，如ERG11、FKS基因突變[13,16]；生物膜的形成以及線(xiàn)粒體缺陷等[17]。

熱帶念珠菌的流行具有地域性區(qū)別，而亞洲地區(qū)是常見(jiàn)的流行高發(fā)區(qū)[17-18]。與白念珠菌相比，國(guó)內(nèi)對(duì)熱帶念珠菌的研究相對(duì)較少，尤其是對(duì)其基因型別和流行病學(xué)的研究。本研究利用多位點(diǎn)序列分型技術(shù)對(duì)上海市瑞金醫(yī)院92株臨床熱帶念珠菌進(jìn)行基因分型，分析得到7個(gè)克隆簇和2個(gè)優(yōu)勢(shì)型別DST507和DST376，有國(guó)外研究報(bào)道的優(yōu)勢(shì)型別為DST232，與國(guó)內(nèi)不同[19]。本研究中得到的47個(gè)DSTs型別，32個(gè)為新型，占68.09%，說(shuō)明臨床上新型熱帶念珠菌出現(xiàn)頻率很高，即管家基因單核苷酸變異率高。本研究中6株屬于單個(gè)MLST型別的菌株耐藥率為16.67%，而屬于優(yōu)勢(shì)型別的27株臨床菌株耐藥率為77.78%，雖然菌株CR16、CR17，菌株CR18、CR19、CR21，菌株CR32、CR33分別來(lái)自于同一個(gè)患者P16、P17和P29，除去此因素，其耐藥率仍為73.91%，這說(shuō)明熱帶念珠菌基因型別可能與其耐藥相關(guān)，已有研究表明熱帶念珠菌基因型別DST98、DST140和DST164與其藥物耐藥有關(guān)[20-22]，但也有研究認(rèn)為這兩者之間無(wú)相關(guān)性[19]。值得注意的是，屬于優(yōu)勢(shì)型別DST507的16株菌株中，有5株耐藥菌株來(lái)源于心臟外科或者心臟外科監(jiān)護(hù)室，5株來(lái)源于急診ICU，這提示我們這些臨床分離菌株可能屬于院內(nèi)患者間互相感染，可能由耐藥菌株不易控制及科室院感質(zhì)控管理不當(dāng)?shù)仍驅(qū)е隆?/p>

綜上所述，熱帶念珠菌作為一種臨床上耐藥率相對(duì)較高的常見(jiàn)條件致病菌，國(guó)內(nèi)對(duì)其研究遠(yuǎn)低于白念珠菌，我們應(yīng)在后續(xù)的研究中對(duì)其予以重視。MLST是一種分辨率高、客觀且各實(shí)驗(yàn)室之間可比性高的基因分型技術(shù)，適用于菌株的流行病學(xué)調(diào)查研究，應(yīng)在以后的研究中增加樣本量，繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)國(guó)內(nèi)熱帶念珠菌的流行病學(xué)研究。

表2 本研究部分菌株藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果