127株結核分枝桿菌基因分型及耐藥相關研究

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2017年發(fā)布的全球結核病報告顯示，2016年新發(fā)現(xiàn)大約1 040萬結核病例，印度、印度尼西亞、中國、菲律賓和巴基斯坦5個國家占56%[1]。利用結核分枝桿菌遺傳標志物(具有遺傳的穩(wěn)定性和個體的多樣性)對結核分枝桿菌臨床分離株進行分型研究，證實菌株的基因多態(tài)性，以此了解結核病的流行病學特征、分析患者產(chǎn)生耐藥的原因、推斷病原演變情況等，對于防治結核病具有重要的意義[2-3]。基于PCR技術的MLVA方法，由于其特異性高、分辨率強、效果明顯、操作簡單方便和重復性好，美國疾病控制和預防中心推薦其為首選的結核桿菌基因分型方法[3]。因為在不同區(qū)域VNTR位點及位點組合有差異性，所以各個實驗室都在盡力尋找適合當?shù)氐奈稽c。本研究采用MLVA技術，選取15個VNTR位點對山西省的127株結核分枝桿菌進行基因分型及藥敏試驗，以初步了解山西長治及周邊地區(qū)結核分枝桿菌分子流行病學特征及耐藥性，為山西省預防和治療結核病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株 127株結核分枝桿菌菌株分別分離自長治市、晉城市和臨汾市的臨床患者痰標本，其中長治106株，晉城20株，臨汾1株。患者年齡16～90歲，平均44歲；男80例(63%)，女47例(37%)；農(nóng)民75例(59.06%)，學生14例(11.02%)，其他38例(29.92%)。長治醫(yī)學院附屬和平醫(yī)院微生物學實驗室負責菌株的培養(yǎng)、鑒定和保存。菌株H37Rv作為參照標準(中國疾病預防控制中心提供)。

1.2主要儀器與試劑 MasterMix(Beijing TsingKe Biotech Co., Ltd)、DL l 000 DNA Marker(Takara)、GoldenView(Aidlab Biotechnologies Co., Ltd)、瓊脂糖、PCR擴增儀、凝膠成像儀及BioNumerics 5.0 分析軟件。

1.3基因分型 依據(jù)參考文獻選取15個VNTR位點[2,4-7](表1)。

表1 15個位點的引物、H37Rv重復單元和擴增片段的長度及重復次數(shù)Tab.1 Primers of 15 locus and the size of repeat, the size of PCR product and the number of repeats of H37Rv strain

15個VNTR位點的引物依據(jù)參考文獻合成。

DNA提取：收集適量經(jīng)Lowenstein Jensen(LJ)培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體于400 μL蒸餾水懸菌，100 ℃金屬浴滅活裂解30 min，14 000 r/min的速度離心10 min，-20 ℃保存上清液以備用。

PCR：混合物總體積為25 μL：DNA模板1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×TaqDNA酶13 μL，三蒸水9 μL。PCR反應條件：預變性94 ℃ 10 min，變性94 ℃ 1 min，退火56 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)，最后延伸72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物在4 ℃保存。

瓊脂糖凝膠電泳：取5 μL擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳(含5 μL/100 mL Golden View)，置于紫外凝膠成像儀下觀察結果，與DNA marker進行比較，估測PCR擴增產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量。實驗中以H37Rv作為陽性對照。

1.4藥敏試驗 對8種抗結核藥物分別采用比例法進行藥物敏感性試驗。培養(yǎng)基中8種藥物的終濃度分別為異煙肼(INH)0.2 μg/mL，利福平(RFP)40 μg/mL，乙胺丁醇(EMB)2 μg/mL，鏈霉素(SM)4.0 μg/mL，卡那霉素(KN)30 μg/mL，丙硫異煙胺(PTH)40 μg/mL，對氨基水楊酸(PAS)1.0 μg/mL，左氧氟沙星(LFX)4.0 μg/mL[5]。耐藥標準：含藥培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基的菌落數(shù)相比，小于l%為敏感，大于或者等于l%為耐藥[5]。

1.5數(shù)據(jù)分析 每株菌株的PCR擴增條帶均與H37Rv比較，確定每株菌株各個VNTR位點重復單元的重復次數(shù)，計算Hunter-Gaston指數(shù)(HGI)分析各位點的分辨能力。采用BioNumerics 5.0軟件進行聚類分析，聚類方式用平均連鎖聚類法(UPGMA)，根據(jù)cluster-cutoff值差異進行基因分型。采用統(tǒng)計軟件SPSS l7.0進行統(tǒng)計分析，運用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行組間差異比較，P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1基因多態(tài)性和聚類分析 運用MLVA方法對127株結核分枝桿菌進行基因分型，DNA指紋圖譜顯示不同菌株表現(xiàn)出明顯的基因多態(tài)性。15個VNTR位點中，Mtub21、MIRU26 和ETRE位點多態(tài)性較高(HGI>0.6)；MIRU10、 ETRA、MIRU27、Mtub39 、Mtub30和MIRU39位點呈中等程度的多態(tài)性(0.3

圖1 127株菌株MLVA基因分型聚類分析Fig.1 Clustering analysis of 127 strains by MLVA

表2 15個VNTR位點的Hunter-Gaston指數(shù)Tab.2 Hunter-Gaston Index of 15 VNTR loci

注：1.Hunter-Gaston指數(shù)：分析VNTR位點重復單元多樣性的指數(shù)(0.0≤HGI≤1.0)；2.可信區(qū)間：多樣性指數(shù)的95%可信區(qū)間。

2.2藥敏試驗 根據(jù)臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準對127株結核分枝桿菌進行藥物敏感性試驗[8]。實驗結果顯示：127株菌株對一線和二線抗結核藥物的總耐藥率分別為47.24%和23.62%。一線抗結核藥物的耐藥率：鏈霉素(40.94%)最高，依次是異煙肼(32.28%)、利福平(24.41%)，乙胺丁醇(6.30%)最低；二線抗結核藥物的耐藥率：左氧氟沙星(14.17%)最高，其次是卡那霉素(8.66%)、對氨基水楊酸(7.09%)，丙硫異煙胺(3.15%)最低。鏈霉素的單耐藥率最高(11.81%)，其次是異煙肼(2.36%)，未發(fā)現(xiàn)利福平和乙胺丁醇的單耐藥菌株；耐多藥率為21.26%(27/127)，其中有5株(3.94%)菌株對四種藥物同時耐藥；廣泛耐多藥率為3.15%(表3)。

2.3基因型與耐藥的關系 Ⅰ群菌株與其它菌株對一線和二線藥物的總耐藥率、一線和二線藥物的耐藥率、單耐藥率、耐多藥率、廣泛耐多藥率如下。Ⅰ群菌株與其它菌株的耐藥率進行比較，兩者間的差異無統(tǒng)計學意義(α=0.05)(表4)。

表3 127株菌株的耐藥情況Tab.3 Drug resistance of 127 strains

3 討 論

MLVA基因分型方法有很多優(yōu)點，不僅特異性高、穩(wěn)定性強，且操作簡便、重復性好，檢測結果還可以數(shù)字表示，不同實驗室之間可相互進行比較。

本研究采用15個VNTR位點對山西省的127株結核分枝桿菌進行基因分型，結果顯示Mtub21、MIRU26和ETRE對于分析山西省的結核分枝桿菌有較高的多態(tài)性；MIRU40、ETRB、ETRD、MIRU23、 ETRC的多態(tài)性較差。先前研究發(fā)現(xiàn)，在北京[9]QUB11b、Mtub21、MIRU39和MIRU16的多態(tài)性較高，青海省[4]菌株中多態(tài)性最好的是MIRU26，徐州[5]結核分枝桿菌的實驗過程中發(fā)現(xiàn)MIRU26和Mtub21多態(tài)性較好，西藏地區(qū)[10]主要是MIRU31、Mtub21和ETRE多態(tài)性較高，四川地區(qū)[11]QUB11b和MIRU26的多態(tài)性較好，在韓國MIRU26和ETRE的區(qū)分力較高[12]，提示不同地區(qū)VNTR位點的多態(tài)性不同，Mtub21、MIRU26和ETRE位點在實驗菌株的分析方面發(fā)揮著重要作用。127株菌株分為11個基因群，以Ⅰ群菌株(80.31%)為主，說明這些菌株屬于親緣關系很近的同一個克隆系，可能為山西長治及周邊地區(qū)的主要流行菌株，應加強對這類菌株的研究[13]。

表4 不同基因型菌株的耐藥性比較Tab.4 Drug resistance comparing in different genotype among strains

注：1，F(xiàn)isher確切概率法

耐藥結核病的流行，尤其是耐多藥患者增多，病程漫長，傳染風險極高，是我國結核病疫情居高不下的重要原因[14]。2010年開展的全國結核病流行病學調(diào)查顯示：一線、二線藥物的總耐藥率為36.8%和24.6%，耐多藥率6.8%[15]。

本次研究結果：一線藥物的總耐藥率為47.27%，耐多藥率為21.26%，顯然高于2010年全國調(diào)查結果，表明長治及周邊地區(qū)結核病耐藥狀況仍然比較嚴重。一線藥物中鏈霉素的敏感性較低，乙胺丁醇的敏感性較高，二線藥物中左氧氟沙星的敏感性較低。鏈霉素是廣譜抗生素，必須與其它藥物聯(lián)合使用，但因其對神經(jīng)和腎的副作用，很多患者不按標準方案用藥或中途停藥，部分醫(yī)生用藥不規(guī)范，是造成鏈霉素耐藥的重要因素[16]。因左氧氟沙星利于痰菌轉陰、影像學療效改善和不良反應少，成為治療耐多藥肺結核的最佳輔助選擇，但氟喹諾酮類藥物對其它致病菌較強的殺菌作用而被普遍使用，增加了它的耐藥率[16-17]。一線藥物中鏈霉素和異煙肼的單耐藥率較高，未發(fā)現(xiàn)利福平和乙胺丁醇的單耐藥菌株，二線藥物的敏感性高于一線藥物。臨床用藥建議：充分發(fā)揮利福平和乙胺丁醇的作用，規(guī)范地聯(lián)合用藥，特別是對于一線藥物高度耐藥的菌株聯(lián)合二線藥物進行治療，以避免耐藥性的產(chǎn)生[18-19]。應加大耐藥結核特別是耐多藥結核的監(jiān)控力度，繼續(xù)加強菌株培養(yǎng)和藥敏試驗，根據(jù)實驗結果制定合理的化療方案或調(diào)整方案[20]。對患者進行隨訪追蹤，監(jiān)督指導，以提高用藥的依從性。

Ⅰ群菌株(主要流行菌株)與其它菌株對一線、二線藥物的總耐藥率、一線和二線藥物的耐藥率、單耐藥率、耐多藥率及廣泛耐多藥率進行比較，兩者間的差異無統(tǒng)計學意義，表明主要流行菌株與耐藥性無明顯相關性。

本實驗標本量有限，在今后的研究中，我們需不斷地加大樣本量，并且結合其它的分型方法——Spoligotyping來共同分析基因型與耐藥之間的關聯(lián)性。