偶氮苯修飾的DNA對(duì)引物延伸的光調(diào)控*

季禾茗，孔德佳，莫蒙武，雷華軍，陳 露，趙瑞琪，王 威，何裕建，封祿田?，吳 麗?

(1 沈陽(yáng)化工大學(xué)應(yīng)用化學(xué)學(xué)院， 沈陽(yáng) 110142； 2 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)化學(xué)科學(xué)學(xué)院， 北京 100049； 3 江西科技師范大學(xué)藥學(xué)院， 南昌 330013)(2017年11月17日收稿； 2018年3月6日收修改稿)

人工操縱特定的生命過(guò)程或基因功能一直是生命科學(xué)的前沿研究方向[1-3]。以往的報(bào)道是利用小分子抑制劑來(lái)抑制特定酶的活性從而調(diào)控生命過(guò)程，即在生命體中引入外源小分子，但外源小分子在一進(jìn)入生命體后就會(huì)立即開(kāi)始發(fā)揮作用，因此很難在時(shí)間和空間上實(shí)現(xiàn)選擇性調(diào)控[4]。近些年來(lái)，科研工作者曾嘗試多種方法以實(shí)現(xiàn)對(duì)生命過(guò)程的多維度調(diào)控，例如改變溫度、改變pH、改變電場(chǎng)、施加磁場(chǎng)、給予光照等。與傳統(tǒng)的外界刺激相比，光作為刺激手段具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[5]。首先光是一種清潔的、非入侵式的外界刺激，已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的光學(xué)照明和熒光成像。其次，光可以精確地從時(shí)間和空間上進(jìn)行宏觀調(diào)控，在光敏物質(zhì)抵達(dá)特定位置后，通過(guò)特定波長(zhǎng)的光照控制藥物的釋放。最后，光控釋放的效率較高，特定波長(zhǎng)的光可激發(fā)某些功能基團(tuán)并發(fā)生各種光化學(xué)反應(yīng)(化學(xué)鍵的斷裂和異構(gòu)化等)。

使用光反應(yīng)變色分子調(diào)控生物過(guò)程具有極好的發(fā)展?jié)摿?，在化學(xué)生物學(xué)、藥物研究和醫(yī)學(xué)具有深遠(yuǎn)的意義。我們和其他研究組曾使用光籠的化合物修飾的核酸，實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)基因表達(dá)的光控制[6-9]。但是這種方法只能單次地增加或降低核酸的活性，不能可逆地控制核酸的功能。偶氮苯是光異構(gòu)化分子的典型代表[10-11]， 化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，光照后異構(gòu)化迅速。母體的反式構(gòu)型(trans)幾乎是平面結(jié)構(gòu)且熱力學(xué)相對(duì)穩(wěn)定，紫外光(UV<366 nm)照后形成穩(wěn)定性較低的具有彎曲構(gòu)象的順式形態(tài)(cis)，而在可見(jiàn)光(>400 nm)光照刺激下又可實(shí)現(xiàn)cis構(gòu)象向trans構(gòu)象的轉(zhuǎn)變[12-14]?；谶@一特性，偶氮苯類(lèi)化合物近年來(lái)被廣泛地應(yīng)用在各種材料領(lǐng)域，例如，光控DNA自組裝[15-16]、光制動(dòng)納米機(jī)械[17]、納米藥物輸送材料[18]等。

近年來(lái)，隨著偶氮類(lèi)化合物光控DNA動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)研究得到迅速的發(fā)展[19-21]，進(jìn)一步增加了人們使用這一工具調(diào)控功能生物大分子(核酸和蛋白質(zhì))的信心[22-23]。這種光響應(yīng)分子通常被引入到核酸不同的結(jié)構(gòu)位置上，例如，磷酸骨架、堿基和核糖體部分等，改變核酸的結(jié)構(gòu)和結(jié)合性能，從而將其應(yīng)用于光開(kāi)關(guān)RNA沉默、基因轉(zhuǎn)錄的可逆控制、適配體的可逆識(shí)別、核糖核酸酶的可逆控制等[24-28]。

新穎的或改進(jìn)的偶氮苯衍生物的設(shè)計(jì)對(duì)于核酸的化學(xué)修飾也是許多化學(xué)工作者爭(zhēng)相研究的熱點(diǎn)[29-30]。在前期研究中，我們已經(jīng)設(shè)計(jì)合成4，4′-二羥甲基偶氮苯的發(fā)夾DNA開(kāi)關(guān)，發(fā)現(xiàn)4，4′-二羥甲基偶氮苯的光異構(gòu)化使得發(fā)夾DNA的穩(wěn)定性發(fā)生巨大改變(ΔTm=24 ℃)[31-32]，并將其置于反義核酸的兩端形成啞鈴型核酸，成功地光控制靶向RNA在RNase H酶作用的降解[33]。從時(shí)間和空間上光控制復(fù)制[34-36]、轉(zhuǎn)錄[37-38]和翻譯[3, 33, 39-40]過(guò)程使得核酸工具分子的發(fā)展越來(lái)越引起人們的關(guān)注。這里，我們研究DNA引物延伸相關(guān)的聚合酶鏈反應(yīng)的光調(diào)控。聚合酶鏈反應(yīng)用于特定DNA序列的試管分離和指數(shù)擴(kuò)增，引物和模板能否形成適當(dāng)穩(wěn)定的雙鏈?zhǔn)欠磻?yīng)的關(guān)鍵因素。如示意圖1，我們?cè)贒NA模板與引物的結(jié)合區(qū)通過(guò)4，4′-二羥甲基偶氮苯的連接加入一段保護(hù)鏈，由于反式的偶氮苯與鄰近的堿基對(duì)之間堆積作用，DNA模板自身形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)而使得其與引物不能夠互補(bǔ)結(jié)合，從而引物延伸不能發(fā)生。反之，通過(guò)紫外光照偶氮苯分子從反式轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖?，這種異構(gòu)化作用所產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)力使得DNA模板的保護(hù)鏈離去，從而DNA模板可以結(jié)合引物，在聚合酶的作用下能夠使得引物延伸進(jìn)行。對(duì)比骨架楔入型偶氮苯的設(shè)計(jì)[34]，通過(guò)偶氮苯共價(jià)鍵連接模板的保護(hù)鏈具有可逆性，并且單一位點(diǎn)的修飾不影響正常的生理活動(dòng)。考慮到發(fā)夾DNA的模板與引物和莖短鏈之間存在結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)，我們使用25 mer長(zhǎng)度的DNA模板和不同長(zhǎng)度的保護(hù)鏈組成的發(fā)夾DNA，通過(guò)篩選發(fā)夾DNA的長(zhǎng)度分別為5、6、7和8個(gè)堿基長(zhǎng)度的保護(hù)鏈，以及長(zhǎng)度為12，15和17 mer的引物，發(fā)現(xiàn)能夠高效調(diào)控引物延伸的發(fā)夾DNA和引物組合，為從時(shí)間和空間上動(dòng)力學(xué)控制生理?xiàng)l件下生物活性分子提供非常有用的工具，也將為分子水平上研究基因功能、基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)以及疾病的發(fā)生和發(fā)展提供一種新的策略和研究手段。

圖1 偶氮苯亞磷酰胺單體的合成Fig.1 Synthetic procedure of azobenzene phosphoramidite

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用的藥品是分析純。所有溶液用超純水配制。對(duì)硝基苯甲醇，4，4′-二甲氧基三苯基氯甲烷，四氮唑，雙(二異丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦均購(gòu)自偶合公司；鋅粉，冰醋酸，四氫呋喃購(gòu)自Macklin公司；色譜級(jí)乙腈購(gòu)自阿拉丁公司；4種脫氧核苷購(gòu)自蕪湖華仁科技有限公司。引物訂購(gòu)自生工公司；DNA聚合酶訂購(gòu)自NEB。

1.2 主要儀器設(shè)備

儀器使用AVANCE的III型400 M核磁共振儀；Applied Biosystems的ABI 394型DNA合成儀；安捷倫1260高效液相色譜系統(tǒng)；島津UV1800紫外分光光度計(jì)和BIO-RAD的ChemiDoc XRS高靈敏化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)。

1.3 偶氮苯衍生物的合成

1.3.1 合成4，4′-二羥甲基偶氮苯

參考前期的工作[31]。稱(chēng)取6.0 g(26 mmol)對(duì)硝基苯甲醇，配制并加入70 mL(5.7 mol/L)的氫氧化鈉水溶液，升溫至100 ℃，再緩慢投入7.0 g(100 mmol)鋅粉，回流攪拌1 h，過(guò)濾得到橙色濾渣。再用甲醇溶解濾渣，在空氣下加熱至回流反應(yīng)8 h。最后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去甲醇，得到3.4 g橙色固體，收率為56.6%。

1.3.2 合成4-羥甲基-4′-羥甲基-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-偶氮苯

稱(chēng)取4，4′-二羥甲基偶氮苯1.5 g(6.5 mmol)溶解在40 mL無(wú)水四氫呋喃中，分3批次，按每次投料間隔3 h的方法共加入4，4′-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMT-Cl)2.1 g(6.5 mmol)，反應(yīng)全程通氮?dú)獗Ｗo(hù)，TLC板監(jiān)測(cè)進(jìn)程。最后得到原料，DMT一取代，DMT二取代的混合粗產(chǎn)品。濕法上樣過(guò)柱層析分離，最后得到4-羥甲基-4′羥甲基-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-偶氮苯2.0 g，收率為55.5%。

1.3.3 合成4-羥甲基-(β-氰乙基-N,N′-二異丙基亞磷酰胺)-4′-羥甲基-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-偶氮苯

稱(chēng)取上一步得到的產(chǎn)物0.160 g(0.290 mmol)，加入四氮唑0.021 g(0.30 mmol)，干燥過(guò)夜。抽真空后氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入磷試劑0.120 g，最后用針筒打入2 mL重蒸后的乙腈使產(chǎn)物的濃度為0.15 mmol/mL左右，隨后冰浴下攪拌反應(yīng)30 min，TLC板監(jiān)測(cè)，反應(yīng)完成后，用0.22 μm有機(jī)系濾膜過(guò)濾，待下一步DNA合成使用。

1.4 偶氮苯衍生物修飾DNA的固相合成

用DNA固相合成儀按照常規(guī)合成的方法經(jīng)過(guò)脫DMT、ETT活化、偶聯(lián)、蓋帽，氧化的步驟將DNA核苷亞磷酰胺單體由3’端向5’端連接到固相。其中普通DNA單體的偶聯(lián)時(shí)間為120 s，偶氮苯衍生物單體的偶聯(lián)時(shí)間增加到600 s。直到所有的亞磷酰胺單體依次偶聯(lián)到CPG的寡聚核酸上，即可得到目標(biāo)序列的固相。

1.5 純化偶氮苯衍生物修飾的DNA

將得到的固相加入1 mL的濃氨水，50 ℃下氨解8 h后離心，取上清液濃縮后過(guò)濾，HPLC提純制備。液相色譜條件：紫外檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，流動(dòng)性A為T(mén)EAA，B為乙腈；梯度洗脫程序：0～40 min，0～40% B；40～45 min，40%～100% B；45～50 min，100% B；50～55 min，100%～0 B；55～60 min，0 B；流速1.0 mL/min；柱溫：40 ℃。最后取得目標(biāo)峰溶液加乙酸做脫DMT處理，濃縮旋干后加25 μL NaCl溶液(3 mol/L)，渦旋溶解，最后加入1 mL無(wú)水乙醇溶液。置于-20 ℃冰箱過(guò)夜，然后離心(1 000～13 000 rpm)，固體保存標(biāo)記，上清液移至另外的EP管中，取400 pmol DNA的量做ESI-MS質(zhì)譜鑒定。

1.6 偶氮苯修飾DNA的光異構(gòu)化

將C1到C4序列溶解在1×PBS中配成2.5 μmol/L的溶液，退火后轉(zhuǎn)移至石英比色皿先用紫外燈(365 nm, 7mW/cm2,反式到順式)照射，用島津UV 1800紫外分光光度計(jì)每間隔20 s測(cè)一次吸光度，120 s后再用白光燈(>400 nm，11 W，順式到反式)照射，每間隔20 s測(cè)一次吸光度，記錄并用軟件Origin 8.0作圖分析。

1.7 Tm值測(cè)定

將樣品溶解在1×PBS樣品溶解標(biāo)準(zhǔn)緩沖液中退火后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測(cè)定梯度溫度下的260 nm紫外吸收(Beckman DU 800 Nucleic Acid/Protein Analyzer程序升溫1 ℃/min)得到熔解曲線，根據(jù)dA/dT作圖得知Tm值。同樣，我們將樣品紫外光照光照10 min(365 nm，11 mW/cm2)再測(cè)定熔解溫度曲線。記錄并用軟件Origin 8.0作圖分析。

1.8 修飾后的DNA引導(dǎo)引物延伸

將引物和模板等比例的溶解于2 μL 10×Thermopol反應(yīng)溶液(20 mmol/L Tris-HCl, 10 mmol/L KCl, 10 mmol/L (NH4)2SO4, 2 mmol/L MgSO4, pH 8.8)中，再加入過(guò)量的dNTP，95 ℃下高溫退火5 min，降溫至室溫后，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，一組不光照，一組用紫外燈(365 nm)照射5 min，然后在黑暗條件下分別孵育10 min使引物和模板鏈充分結(jié)合。最后均加入1 U的DNA聚合酶37 ℃下分別孵育1 h。終反應(yīng)體積為20 μL。通過(guò)20%的變性聚丙烯酰胺凝膠在150 V電壓條件下電泳2 h，最后應(yīng)用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行表征，條帶分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 偶氮苯修飾DNA的合成

參照我們以前的報(bào)道[33]，以對(duì)硝基苯甲醇為原料，在濃NaOH水溶液中，Zn作催化劑合成4，4′-二羥甲基偶氮苯。偶氮苯一端羥基與4，4′-二甲氧基三苯基氯甲烷(DMT-Cl)反應(yīng)進(jìn)行保護(hù)，另一端羥基與2-氰乙基-N，N，N′，N′-四異丙基亞磷酰二胺(磷試劑)反應(yīng)合成偶氮苯的亞磷酰胺單體(圖1)。值得注意的是最后一步與磷試劑反應(yīng)，偶氮苯衍生物的投料比例較少有利于DNA的偶聯(lián)，否則可能剩余部分的磷試劑首先與固相上裸露的羥基反應(yīng)，從而導(dǎo)致偶氮苯偶聯(lián)效率下降。這里，直接以重蒸的乙腈為溶劑，4，4′-二羥甲基偶氮苯: 四氮唑: 磷試劑的投料比例為1∶0.8∶0.8，通過(guò)薄層層析硅膠色譜監(jiān)控偶氮苯原料不再減少，反應(yīng)30 min以上，使得磷試劑反應(yīng)完全，然后將反應(yīng)液過(guò)濾，待用于DNA偶聯(lián)。

偶氮苯修飾DNA合成使用ABI 394 DNA合成儀按照常規(guī)的亞磷酰胺固相合成的方法進(jìn)行。在偶聯(lián)偶氮苯的亞磷酰胺單體時(shí)，將DNA核苷亞磷酰胺單體偶聯(lián)時(shí)間從通常的120 s增加到1 200 s，偶聯(lián)效率幾乎與標(biāo)準(zhǔn)的DNA亞磷酰胺單體相當(dāng)。取下裝有固載相的柱子，再用濃氨水將寡核苷酸從固相上切除并脫保護(hù)，最后進(jìn)行HPLC分離。制備提純后的樣品進(jìn)行ESI-MS質(zhì)譜鑒定，結(jié)果如表1，其實(shí)際測(cè)得的分子量和理論值相符。

表1 偶氮苯修飾的DNA的ESI-MS鑒定Table 1 ESI-MS spectra of azobenzene linked DNA

2.2 偶氮苯修飾DNA的光異構(gòu)化

將偶氮苯修飾的DNA(C1、C2、C3和C4)溶解在1×PBS中配成2.5 μmol/L的溶液，95 ℃下退火形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。反式是偶氮苯的熱穩(wěn)定形式，其紫外光譜在335 nm (π-π*)處呈現(xiàn)明顯的肩峰。對(duì)于C1溶液，通過(guò)365 nm紫外燈照，可以明顯觀察到335 nm處的峰強(qiáng)隨著光照時(shí)間增加而降低，直到照射80 s，此肩峰基本消失，而430 nm(n-π*)處的峰強(qiáng)略有升高(圖2(a))。此外，再用白光光照，335 nm處的峰強(qiáng)隨著光照時(shí)間增加而增強(qiáng)，430 nm處峰強(qiáng)略有下降(圖2(b))。同樣，C2、C3和C4的溶液通過(guò)紫外和可見(jiàn)光照均呈現(xiàn)335 nm和430 nm處峰強(qiáng)的類(lèi)似變化(圖2(c)、2(d)，圖2(e)、2(f)和圖2(g)、2(h))。說(shuō)明偶氮苯被修飾到設(shè)計(jì)的寡核苷酸中，并且能起到光異構(gòu)化的作用。此外，260 nm是核酸的特征吸收峰，在DNA變性時(shí)吸光度升高表現(xiàn)出增色效應(yīng)，說(shuō)明偶氮苯光異構(gòu)化可能影響DNA雙鏈的結(jié)構(gòu)，將進(jìn)一步通過(guò)進(jìn)行熱力學(xué)穩(wěn)定性的研究加以佐證。

圖2 偶氮苯修飾的DNA在不同時(shí)間的紫外和可見(jiàn)光照下紫外光譜的變化Fig.2 UV/Vis absorbance spectra of the C1, C2, C3, and C4 forms of azobenzene linked DNA before and after light illumination

2.3 偶氮苯修飾DNA的熱力學(xué)穩(wěn)定性

我們前期研究[29,31]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)4，4′-羥甲基偶氮苯代替4、5和6個(gè)堿基對(duì)的發(fā)夾DNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，偶氮苯的光異構(gòu)化能夠使得發(fā)夾DNA的穩(wěn)定性發(fā)生巨大改變(ΔTm=24 ℃)。這里進(jìn)一步研究不改變發(fā)夾DNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)上4，4′-羥甲基偶氮苯，僅僅增加一邊莖堿基數(shù)目，偶氮苯的光異構(gòu)化是否仍然可能開(kāi)關(guān)發(fā)夾DNA的穩(wěn)定性。圖3展示紫外光照前后C1、C2、C3和C4的熔點(diǎn)曲線，很明顯發(fā)現(xiàn)C1和C2光照前后的熔鏈曲線有著較大差異(圖3(a)和3(b))，熔點(diǎn)溫度分別從光照前60.2和67.7 ℃，光照后降低到49.8和53.5 ℃，它們?nèi)埸c(diǎn)溫度的變化分別為10.4和14.2 ℃(表2)。這主要因?yàn)榕嫉降漠悩?gòu)化影響其與鄰位堿基之間堆積作用以及鄰位堿基對(duì)的氫鍵作用，導(dǎo)致寡聚核酸的穩(wěn)定性降低。尤其是C2，具有6個(gè)堿基對(duì)，紫外光照后的穩(wěn)定性降低(ΔTm=14.2 ℃)最多。然而，隨著莖堿基數(shù)目的增多，偶氮修飾的DNA通過(guò)紫外光照后的穩(wěn)定性降低的程度變小，C3的ΔTm僅是6.9 ℃而莖堿基數(shù)目增加到8個(gè)堿基對(duì)(C4)時(shí)光照后的Tm值幾乎沒(méi)有變化。這可能是偶氮苯兩端互補(bǔ)配對(duì)的序列太長(zhǎng)(≥8 bp)，偶氮苯異構(gòu)化所產(chǎn)生的扭轉(zhuǎn)力不足以影響雙鏈的結(jié)合。

圖3 偶氮苯修飾的DNA光照前后的熔點(diǎn)曲線Fig.3 Typical melting curves of the C1, C2, C3, and C4 forms of azobenzene linked DNA before and after UV irradiation

DNATm/℃- UV+UVΔTm/℃C160.249.810.4C267.753.514.2C370.263.36.9C474.473.80.6

2.4 偶氮苯修飾DNA與引物結(jié)合的光控制

引物延伸的基本原則之一是引物與模板序列要緊密互補(bǔ)結(jié)合，因而偶氮苯修飾的DNA作為模板能否和引物形成適當(dāng)穩(wěn)定的雙鏈?zhǔn)且镅由斓年P(guān)鍵因素。在偶氮苯修飾的DNA中較長(zhǎng)的莖堿基鏈原則上與引物互補(bǔ)結(jié)合，但是短鏈與長(zhǎng)鏈形成的莖堿基對(duì)的穩(wěn)定性可能影響長(zhǎng)莖堿基鏈與引物的結(jié)合，而偶氮苯異構(gòu)化可能影響莖堿基對(duì)的穩(wěn)定性。因此，考慮到發(fā)夾DNA的長(zhǎng)鏈莖與引物和短鏈莖之間存在結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)，我們通過(guò)篩選發(fā)夾DNA的短鏈長(zhǎng)度分別為5、6、7和8個(gè)堿基長(zhǎng)度的C1、C2、C3和C4，以及長(zhǎng)度為12 mer(Pri.12)，15 mer(Pri.15)和17 mer(Pri.17)的引物，評(píng)價(jià)偶氮苯修飾的DNA與引物結(jié)合的光調(diào)控。

圖4(a)顯示Pri.12和模板序列光照前后都沒(méi)有很好的結(jié)合，可能因?yàn)楸旧硪镦溇捅容^短，模板鏈自身能形成雙鏈結(jié)構(gòu)的部分較引物長(zhǎng)，即使是偶氮苯在順式形態(tài)下，影響模板的雙鏈結(jié)構(gòu)，但C1、C2、C3，C4模板單鏈部分和引物能互補(bǔ)配對(duì)的長(zhǎng)度為7、6、5和4 bp，仍然是不穩(wěn)定結(jié)合，所以在凝膠電泳上無(wú)法看到Pri.12和模板的結(jié)合。當(dāng)Pri.15和C1、C2、C3，C4模板單鏈部分能互補(bǔ)配對(duì)的長(zhǎng)度增加為10、9、8和7 bp，引物依舊無(wú)法很好的參與模板鏈自身形成的雙鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。圖4(b)顯示Pri.15和C1只有微弱的結(jié)合，而其和C2、C3、C4都不穩(wěn)定結(jié)合。不同的是當(dāng)Pri.17和C1、C2、C3，C4模板單鏈部分能互補(bǔ)配對(duì)的長(zhǎng)度增加為12、11、10和9 bp時(shí)，C1和Pri.17可以形成較為穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)，這意味引物和模板長(zhǎng)鏈部分互補(bǔ)配對(duì)的長(zhǎng)度為12 bp時(shí)，引物和模板能夠有相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)合，而光照前后這種結(jié)合力的變化不是很明顯。正如所期望的，C2和Pri.17孵育后在光照前幾乎沒(méi)有結(jié)合，而在光照后它們有明顯的結(jié)合條帶，結(jié)合部分增加7%左右。由于保護(hù)鏈的增長(zhǎng)，C3、C4和Pri.17在光照前后變化也不太明顯。

圖4 偶氮苯修飾的DNA和引物結(jié)合的光調(diào)控Fig.4 Photoregulation of the binding of azobenzene linked DNA with the primer

2.5 偶氮苯修飾的DNA指導(dǎo)引物延伸的光調(diào)控

反式是偶氮苯的熱穩(wěn)定形式，起到穩(wěn)定模板鏈自身雙鏈結(jié)構(gòu)的作用，所以引物鏈不能很好與模板鏈緊密結(jié)合，降低了引物的延伸產(chǎn)率。當(dāng)受外界的紫外光刺激時(shí)，偶氮苯能在比較短的時(shí)間發(fā)生異構(gòu)化轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖浇Y(jié)構(gòu)，破壞模板鏈自身雙鏈的堿基堆疊與配對(duì)作用，導(dǎo)致雙鏈不穩(wěn)定，結(jié)合力降低。同時(shí)引物與模板鏈不僅存在著配對(duì)關(guān)系，還會(huì)與模板的莖短鏈存在著競(jìng)爭(zhēng)配對(duì)，從而徹底打開(kāi)模板自身的雙鏈結(jié)構(gòu)，引物和模板緊密結(jié)合，進(jìn)行DNA的復(fù)制。雖然影響引物延伸的因素有很多，但是我們主要從DNA模板、不同長(zhǎng)度的引物和不同的酶這三方面來(lái)研究并篩選光控引物延伸最佳效率的條件。

由圖5可見(jiàn)，膠圖中最下方的條帶為起始引物條帶，最上面的條帶為延伸全長(zhǎng)產(chǎn)物，中間的片段為反應(yīng)過(guò)程中未完全延伸的產(chǎn)物。在以Pri.12作為引物時(shí)，其與C1、C2、C3和C4配對(duì)區(qū)的堿基對(duì)分別為7、6、5和4 bp。由圖5(a)和6(a)可知，C1作為模板，紫外光照前，在Taq、Vent、Deep Vent酶的作用下引物延伸產(chǎn)率分別為37.5%，26.7%和31.7%，而紫外光照后，引物延伸產(chǎn)率存在不同程度增加(48.6%，40.7%和37.2%)。與C1相比，C2和C3，模板鏈的保護(hù)短鏈分別從5個(gè)堿基增加到6和7個(gè)堿基，與引物配對(duì)的堿基對(duì)也相應(yīng)從7 bp減少到6和5 bp，引物延伸的效率通常有所下降。且它們自身經(jīng)紫外光照后，引物延伸產(chǎn)率比光照前也存在不同程度增加。這是因?yàn)殡S著模板鏈自身的雙鏈長(zhǎng)度增加，配對(duì)區(qū)長(zhǎng)度逐漸減短，結(jié)合力變?nèi)?，引物在?jìng)爭(zhēng)位置逐漸處在劣勢(shì)，大大降低了模板和引物的結(jié)合，所以延伸的產(chǎn)率逐漸減少。C1、C2和C3光照前后指導(dǎo)的引物延伸都有5%～15%的差異，正如我們所預(yù)期的，偶氮苯的順式形態(tài)影響了模板自身雙鏈的穩(wěn)定性，通過(guò)配對(duì)區(qū)的結(jié)合，引物“擠走”競(jìng)爭(zhēng)區(qū)的干擾堿基從而自身參與模板鏈的結(jié)合，從而增加延伸效率。而C4光照前后引物的延伸幾乎都不明顯，這也與光照前后Tm值無(wú)明顯變化的結(jié)果相一致，偶氮苯開(kāi)關(guān)不足以使得12 mer引物對(duì)8 bp長(zhǎng)度的莖堿基對(duì)有所影響。

在以Pri.15作為引物時(shí)，其與C1、C2、C3和C4配對(duì)區(qū)的堿基對(duì)增加為10、9、8和7 bp，因而較Pri.12表現(xiàn)出更強(qiáng)的結(jié)合力，提高了“擠走”競(jìng)爭(zhēng)區(qū)模板端位短鏈的可能性。圖5(b)和6(b)顯示，Pri.15作為引物表現(xiàn)出比Pri.12更多量的聚合物鏈反應(yīng)產(chǎn)物。此外，光照前后引物延伸效率差異比較明顯，其中C3，在Vent酶作用下引物延伸效率僅為28.4%，而紫外光照后引物延伸效率達(dá)到57.8%，光照前后的PCR產(chǎn)率增加超過(guò)1倍。在Deep Vent酶的作用下C3光照前后指導(dǎo)的PCR產(chǎn)率也增加73%。C2在Vent作用下光照后指導(dǎo)的PCR產(chǎn)率很高(91.8%)，但光照前指導(dǎo)PCR反應(yīng)產(chǎn)率也較高(63.1%)，因而光照前后的產(chǎn)率也表現(xiàn)出差異，僅為28.7%。對(duì)于C4，不管是光照前還是光照后，其指導(dǎo)的引物延伸產(chǎn)率都比較低，偶氮苯開(kāi)關(guān)仍不足以使得15 mer引物對(duì)8 bp長(zhǎng)度的莖堿基對(duì)有所影響。

在以Pri.17作為引物時(shí)，其與C1、C2、C3和C4配對(duì)區(qū)的堿基對(duì)增加為12、11、10和9 bp，因而較Pri.12和Pri.15表現(xiàn)出更強(qiáng)的結(jié)合力，“擠走”競(jìng)爭(zhēng)區(qū)模板端位短鏈的可能性更大。圖5(c)和圖6(c)均顯示，C1光照前引物延伸的效率已經(jīng)很大(83.2%以上)，紫外光照后引物延伸的效率96.0%以上，由于光照前的背景較高，所以光照前后PCR效率沒(méi)有明顯的變化。說(shuō)明偶氮苯開(kāi)關(guān)調(diào)控的影響不大，原因是配對(duì)區(qū)的雙鏈較長(zhǎng)，即使是競(jìng)爭(zhēng)區(qū)引物不能和模板鏈緊密結(jié)合，配對(duì)區(qū)也能夠指導(dǎo)引物繼續(xù)延伸。然而，C2，由于配對(duì)區(qū)的堿基對(duì)增加，紫外光照前降低了引物延伸效率的背景，Vent催化下延伸產(chǎn)率僅為49.6%，紫外光照射后的延伸產(chǎn)率達(dá)到91.4%，增加了84%。C3的調(diào)控比C2的調(diào)控略有不足，而C4受到偶氮苯自身調(diào)控能力和配對(duì)區(qū)結(jié)合力的限制延伸結(jié)果也不夠理想。

此外，使用同一種DNA模板，在不同酶的作用下，引物延伸的調(diào)控效果只有略微的區(qū)別，其中Vent酶表現(xiàn)略好的調(diào)控效果。更多的影響調(diào)控效果的是DNA模板和引物的組合，這是由于發(fā)夾DNA的模板與短保護(hù)鏈和引物之間存在結(jié)合的競(jìng)爭(zhēng)。我們發(fā)現(xiàn)，具有7個(gè)保護(hù)堿基的C3對(duì)Pri.15及6個(gè)堿基短鏈的C2對(duì)Pri.17具有普遍較好的光調(diào)控延伸效果。其中C3，在Vent酶作用下紫外光照前后引物延伸效率增加超過(guò)1倍。而C2，由于引物長(zhǎng)度增加，盡管紫外光照前增加了引物延伸的背景，但Vent催化下紫外光照射后的延伸產(chǎn)率達(dá)到91.4%，也增加了84%，這也與DNA與引物的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中光照前后具有不同的結(jié)合力相一致。

2.6 偶氮苯修飾的DNA指導(dǎo)引物延伸的可逆研究

為評(píng)價(jià)偶氮苯引入到核酸分子中對(duì)引物延伸的可逆調(diào)控，我們選擇C2序列與Pri.15在Vent酶作用下，通過(guò)紫外光和可見(jiàn)光交替照射來(lái)研究引物延伸的可逆行為。圖7(a)表示溶液退火后37 ℃下共孵育58 min，18和38 min分別用UV光和可見(jiàn)光照射2 min，每隔9 min取等量溶液電泳表征(光照時(shí)間除外)。線性結(jié)果如圖7(b)，前18 min反應(yīng)速率線性擬合為1.22，UV光照射后反應(yīng)加快，斜率為2.17，增加1.7倍，可見(jiàn)光照后反應(yīng)速率又下降到較低水平，僅為0.4。證明偶氮苯修飾的模板能夠可逆的控制引物延伸速率。

圖7 偶氮苯修飾的DNA(C2)指導(dǎo)引物延伸的可逆光調(diào)控Fig.7 Reversible photoregulation of primer extension using C2 with UV and visible light

3 結(jié)論

本文研究偶氮苯單元修飾在DNA模板上對(duì)引物延伸的光控制行為，篩選5、6、7和8個(gè)堿基的保護(hù)鏈通過(guò)4，4′-二羥甲基偶氮苯連接的25 mer DNA模板，在紫外光照前后調(diào)控的引物延伸效率。結(jié)果表明具有7個(gè)保護(hù)堿基的C3對(duì)Pri.15及6個(gè)堿基短鏈的C2對(duì)Pri.17具有普遍較好的光調(diào)控延伸效果，并且因聚合酶的改變而對(duì)引物的調(diào)控效果只有略微不同。因而我們斷定偶氮苯修飾的DNA模板對(duì)引物延伸的光控制行為的主要影響是因?yàn)榕嫉絾卧揎椖０逅纬傻母?jìng)爭(zhēng)區(qū)和引物與模板形成的配對(duì)區(qū)之間的相互競(jìng)爭(zhēng)。