蘿卜與蕓薹屬遠(yuǎn)緣雜交不親和性克服及DNA甲基化的研究進(jìn)展

郭曉燦 韓佳慧 童未名

摘要：通過遠(yuǎn)緣雜交可以獲得種內(nèi)雜交難以得到的變異類型，創(chuàng)造許多新的種質(zhì)資源，為品種改良提供原材料。從20世紀(jì)20年代開始，人們就已經(jīng)開展了蘿卜屬與蕓薹屬植物遠(yuǎn)緣雜交的研究，并有不少屬間雜交成功的報道。本文綜述了當(dāng)前蘿卜與蕓薹屬屬間不親和性的機(jī)制，總結(jié)了不親和性的克服方法，并概括了不同屬間遠(yuǎn)緣雜種的育性和DNA甲基化的研究進(jìn)展，以期為今后蘿卜與蕓薹屬蔬菜品種的遺傳育種工作提供參考。

關(guān)鍵詞：蘿卜;蕓薹屬;遠(yuǎn)緣雜交;不親和性;DNA甲基化;研究進(jìn)展;表觀遺傳

中圖分類號： S631.103.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0012-06

蘿卜（Raphanus sativus L.）是我國主要的蔬菜作物之一，為十字花科蘿卜屬一、二年生草本植物，其肉質(zhì)根營養(yǎng)豐富，且蘿卜的栽培地區(qū)廣，品種類型多[1]。蕓薹屬（Brassica）植物種類繁多，用途廣泛，具有遺傳類型豐富、變異廣泛的基因庫。蕓薹屬植物的遠(yuǎn)緣雜交不僅涉及該屬內(nèi)的種間雜交，而且涉及與鄰近屬物種進(jìn)行的屬間雜交。Karpechenko首先進(jìn)行了蘿卜與甘藍(lán)的遠(yuǎn)緣雜交，并獲得高度不育的遠(yuǎn)緣雜種F1代[2]。此外，王明霞的研究表明，蘿卜屬與蕓薹屬的遺傳相似水平較高，而且通過遠(yuǎn)緣雜交可以將蘿卜屬的抗蟲能力[3]，如抗根結(jié)線蟲、孢囊線蟲[4]和雄性不育系[5]、抗根腫病[6-7]等特異性狀導(dǎo)入蕓薹屬作物中，能夠?qū)崿F(xiàn)作物之間優(yōu)異性狀的轉(zhuǎn)移，創(chuàng)造蔬菜新品種和新類型。然而，在進(jìn)行種間或?qū)匍g雜交時，如果采用常規(guī)的雜交技術(shù)，成功率往往很低。人們通過混合花粉和多次重復(fù)授粉、柱頭移植、剪短法和化學(xué)藥劑的使用等方法來克服受精前的障礙，但受精后，在胚胎的發(fā)育過程中，由于胚乳得不到正常發(fā)育的營養(yǎng)，導(dǎo)致胚的死亡[8]。在1959年研究者首先用幼胚培養(yǎng)的方法獲得了蕓薹屬內(nèi)的種間雜種，之后許多學(xué)者采用組織培養(yǎng)技術(shù)使種間、屬間雜交的結(jié)實率和雜種的獲得頻率得到了提高。

遠(yuǎn)緣雜交在創(chuàng)造新種質(zhì)、雜種優(yōu)勢利用和品種改良等應(yīng)用領(lǐng)域具有重要的現(xiàn)實意義，在物種的起源、演化和遺傳變異研究方面也發(fā)揮著重要的指導(dǎo)作用。本文就蘿卜與蕓薹屬間的遠(yuǎn)緣雜交不親和性、異源多倍體的獲得及遠(yuǎn)緣雜種的鑒定等研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 蘿卜與蕓薹屬遠(yuǎn)緣雜交不親和性的影響因素

在種間或種以上的分類單位，由于在形態(tài)、遺傳和生理上存在較大不同，從而導(dǎo)致雜交不能正常結(jié)實和獲得雜種。表1中匯總了關(guān)于蘿卜與蕓薹屬間雜交的實例，蘿卜與蕓薹屬“禹氏三角”中的3個基本種白菜（Brassica rapa L.）、黑芥（Brassica nigra L.）、甘藍(lán)（Brassica oleracea L.），以及3個復(fù)合種埃塞俄比亞芥（Brassica carinata L.）、芥菜（Brassica juncea L.）、甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）和野生蕓薹種均有雜交成功的實例，并且有的正反交都獲得了一定的結(jié)實率和雜種獲得率，揭示蘿卜屬與蕓薹屬的親緣關(guān)系較近。此外可以看出，不僅不同雜交親本和組合方式下遠(yuǎn)緣雜交不親和性的程度不同，而且同一雜交組合下正反交的雜種獲得率也有很大差異。組培技術(shù)出現(xiàn)后，在蘿卜與蕓薹屬遠(yuǎn)緣雜交中均采用子房培養(yǎng)、幼胚培養(yǎng)和胚珠培養(yǎng)等組培技術(shù)進(jìn)行胚挽救，結(jié)果是卓有成效的。從表1還可以看出，通過組織培養(yǎng)和整花培養(yǎng)技術(shù)使結(jié)實率、雜種獲得頻率得到了提高，并對雜種進(jìn)行加倍，獲得異源四倍體、異源六倍體等，使雜種后代的育性得到了提高，有效克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和性。

1.1 雜交親本的基因組和基因型

在一般情況下，雜交父母本的親緣關(guān)系越近，獲得雜種的頻率越高。通過利用基因組原位雜交（GISH）和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）技術(shù)對部分回交后代（BC1）的基因組組成分析可知，F(xiàn)1代雜種的白菜基因組（AA）和蘿卜基因組（RR）間的染色體配對頻率較高，在73.53%的花粉母細(xì)胞（PMCs）中形成異源合價體，表明2個基因組之間存在顯著的同源重組[37]，如蘿卜與白菜雜交更容易獲得雜種[4，15，38]。表2是對表1中獲得的遠(yuǎn)緣雜種頻率進(jìn)行匯總的結(jié)果，也揭示了蘿卜與白菜、甘藍(lán)的遠(yuǎn)緣雜種獲得率顯著高于黑芥組合。另外，基因組測序比對表明，蘿卜基因組與蕓薹屬基因組共同經(jīng)歷了基因三倍體化的事件，有著共同的進(jìn)化祖先物種[39]。因此可見，親本的基因組體系對屬間雜交的可交配性起著決定性作用[11]。在遠(yuǎn)緣雜交中，不同基因型的親本也影響著雜種的結(jié)實率，如黃邦全等研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的蘿卜與Ogura紫菜薹雜交，紫菜薹Ogura CMS與四季蘿卜雜交的結(jié)實率明顯高于紫菜薹Ogura CMS與南畔晚蘿卜雜交的結(jié)實率[17]。

1.2 雜交親本的染色體數(shù)目

遠(yuǎn)緣雜交中雜交親本的親和性與親本的染色體數(shù)目呈正相關(guān)，有研究表明，具有相同染色體組的2個親本的親和性較強，易得到雜種。此外，羅鴻源的試驗還表明，染色體數(shù)目多的物種作母本的結(jié)角率較高（6.2%～71.7%），獲得遠(yuǎn)緣雜種的成功率也較高[40]。從表2中也不難看出，蘿卜與蕓薹屬復(fù)合種雜交獲得雜種的頻率明顯高于與基本種雜交，是否與復(fù)合種的染色體數(shù)目相關(guān)，還有待具體分析。

1.3 子房離體培養(yǎng)的取材時間

授粉后雜種子房離體培養(yǎng)的取材時間早晚會影響子房的成活率，必須在角果停止生長、胚敗育之前進(jìn)行組織培養(yǎng)，從而為雜種胚提供正常生長所需的營養(yǎng)，雜種獲得率也可以提高。李明山等在蘿卜與大白菜的屬間雜交試驗中發(fā)現(xiàn)，在授粉第15天后，胚乳開始變褐退化，但胚仍是健康的[13]。然而，相關(guān)研究表明，蘿卜與大頭菜的最佳取材時間是授粉后的第7天[27]。雖然都是蘿卜與蕓薹屬的屬間雜交，但是不同親本及雜交組合方式的最佳取材時間會不盡相同。周清元曾探討過取材時間對蕓薹屬植物雜交結(jié)實率的影響[41]?？梢钥闯?，過早或過晚的取材時間都會影響遠(yuǎn)緣雜交的結(jié)莢率和結(jié)實率。

1.4 單向不親和性

在蘿卜屬與蕓薹屬的屬間雜交中，單向?qū)匍g不親和性普遍存在。例如在蘿卜與甘藍(lán)種的雜交中，以蘿卜作為父本容易獲得雜種[42]，與表2的結(jié)論一致。Inomata在白菜與甘藍(lán)的雜交組合中也發(fā)現(xiàn)，子房培養(yǎng)顯著提高了正交組合的雜種獲得率，但對于反交的效果甚微[43]。如陳洪高在遠(yuǎn)緣雜種（蘿卜/芥藍(lán)）與蘿卜雜交的研究中發(fā)現(xiàn)，以雜種（蘿卜/芥藍(lán)）作為母本時的親和性大于以蘿卜為母本時的親和性[35]。在表2中也明確了單向不親和性現(xiàn)象的存在，即同一組合在正反交不親和性方面也有一定的差異。

2 不親和性的克服方法

2.1 受精指數(shù)高雜交組合與授粉時間

受精指數(shù)與結(jié)實指數(shù)間存在較高的遺傳相關(guān)性（r=0.656）[44]，選擇受精指數(shù)高的雜交組合對于克服不親和性有積極影響。吳江生等在甘藍(lán)型油菜與芥菜型油菜的試驗中發(fā)現(xiàn)，受精指數(shù)與結(jié)角率和角果長度均達(dá)到0.001的顯著水平[45]。研究表明，在抑制不親和反應(yīng)的因素未發(fā)生作用之前的蕾期對柱頭進(jìn)行授粉，花粉管可正常生長進(jìn)入子房到達(dá)胚囊。母本柱頭對花粉的識別能力最低時期不僅在柱頭未成熟時，還在過成熟時[46]。因此，在開花前期或后期進(jìn)行授粉，可以克服遠(yuǎn)緣雜交不親和性[47-48]。

2.2 克服受精前障礙

大量研究表明，蕾期重復(fù)授粉、混合授粉、涂抹化學(xué)藥劑和輻射誘變種子等方法可以克服遠(yuǎn)緣雜交受精前的障礙。例如在蘿卜×蕪菁[49]、甘藍(lán)型油菜×蘿卜[12]屬間雜交中采用甘氨酸（Gly）、赤霉素（GA3）、氯化鈉（NaCl）取得了良好的效果;利用輻射誘變和重復(fù)授粉[50]提高了蘿卜×大白菜[40]的雜種獲得率。此外研究發(fā)現(xiàn)，花粉萌發(fā)液和重復(fù)授粉[40]對于克服蘿卜與蕓薹屬的屬間雜交不親和性有著顯著作用。

2.3 不育系材料作母本

以蘿卜雄性不育植株為母本、甘藍(lán)型油菜為父本進(jìn)行授粉，得到34株雜種（蘿卜/甘藍(lán)型油菜）[29]。同樣的，在克服油菜雜交不親和的研究中也發(fā)現(xiàn)，以白菜型的不育材料作母本組合的平均結(jié)角率比以育性正常的材料作母本組合的結(jié)角率增加了14倍以上[40]。上述研究說明，在蘿卜屬與蕓薹屬雜交中，用不育性材料作母本可以提高遠(yuǎn)緣雜交的親和性，這為蘿卜與蕓薹屬的屬間雜交育種提供了參考。

2.4 組織培養(yǎng)技術(shù)

遠(yuǎn)緣種間在遺傳上的差異較大，造成生理上的不協(xié)調(diào)，所以在原胚至球形胚以及在有絲分裂和合成新的細(xì)胞質(zhì)等方面時遇到障礙，就會發(fā)生雜種胚的敗育。胚的發(fā)育與胚乳的營養(yǎng)供應(yīng)有關(guān)，組培技術(shù)的出現(xiàn)可以及時為幼胚發(fā)育提供營養(yǎng)。Tokumasu等在蘿卜屬與蕓薹屬的屬間雜交中都使用雜種胚離體技術(shù)，使得雜種獲得率普遍提高[51]。然而組織培養(yǎng)技術(shù)最重要的是為雜交種創(chuàng)造一個適宜的環(huán)境，在培養(yǎng)基中添加適量的生長物質(zhì)、糖、無機(jī)鹽、激素及控制培養(yǎng)溫度、光照等對雜交種的成長有著促進(jìn)作用[52]。有研究表明，采用改良液體培養(yǎng)基胚的生長速度、成活率均顯著高于固體培養(yǎng)基[13]。

3 遠(yuǎn)緣雜種的育性

遠(yuǎn)緣雜種的育性主要包括雜種的成活性和結(jié)實性。成活性是指雜種種子不能發(fā)芽、幼苗衰弱或者死亡。由于染色體的不同源性，在減數(shù)分裂時常發(fā)生染色體不能進(jìn)行正常配對聯(lián)會及隨之產(chǎn)生的不規(guī)則分配，因而導(dǎo)致雜種植株不結(jié)實，表現(xiàn)為雜種不育。

染色體加倍可以克服減數(shù)分裂時染色體不能正常配對引起的雜種不育性，提高雜種成活率和后代結(jié)實率[12]。秋水仙素處理法是染色體加倍常用的方法，但處理的方法和效果是不同的。（1）涂抹法。用藥棉蘸秋水仙素涂抹雜種著生腋芽處，如在蘿卜與蕓薹屬間雜交時，處理的雜種均在花蕾較小時便變黃脫落或者開花后不能受精，不能使染色體加倍成功[12]。李勤菲等采用秋水仙堿滴生長點、浸根和秋水仙堿培養(yǎng)基等3種方法處理蕓薹屬三倍體幼苗，其中滴生長點誘導(dǎo)率最低，為17.54%[53]。（2）浸根法。如采用0.15%秋水仙素處理蘿卜、甘藍(lán)的屬間雜種，51.0%的植株為嵌合體，21.3% 的植株加倍過度，27.7%的雜種植株未加倍成功[20]。采用秋水仙素浸根加倍方法簡單有效，但得到的大多數(shù)為嵌合體。（3）組培加倍法。秋水仙素滅菌的方法有濕熱高壓滅菌和抽濾滅菌方法，在濕熱高壓滅菌后，含有秋水仙素的培養(yǎng)基上愈傷組織的生長沒有發(fā)生藥害，再生苗/愈傷組織的誘導(dǎo)率為147.2%，再生植株的結(jié)實率為48.1%;而抽濾滅菌的結(jié)果則相反，再生苗/愈傷組織的誘導(dǎo)率僅為3.3%，再生植株的結(jié)實率為0[54]?？赡苁怯捎谇锼伤貫橐环N生物堿，用高壓滅菌鍋滅菌時，秋水仙素可能發(fā)生改性而使有效濃度降低。而且將甘藍(lán)型油菜與藍(lán)花子（Raphanus sativus L.var. raphanistroides Makino）F1代組培苗轉(zhuǎn)入含有秋水仙素的固體培養(yǎng)基中，后期鑒定發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)為雙二倍體[55]，嵌合體的頻率降低。

綜上所述，蘸秋水仙素涂抹雜種腋芽不能使雜種加倍，可能由于采用涂抹法時，秋水仙素不易滲入莖尖生長點組織;浸根加倍往往得到的是嵌合體，原因可能是煉苗后植株的根系比較發(fā)達(dá)，可能是由于根系運輸秋水仙素未能到達(dá)所有生長點而不能使其整株加倍成功，也可能是由于植株的生長速度高于加倍細(xì)胞的分化和增殖速度，也有可能是由于操作不仔細(xì)，秋水仙素使部分莖葉加倍。而使用添加秋水仙素的固體培養(yǎng)基處理時間長，可以徹底抑制紡錘體的形成而產(chǎn)生雙二倍體，但是不易確定合理的濃度，所以要注意濃度的使用，過高過低都會影響雜種生長。

4 表觀遺傳學(xué)

DNA甲基化涉及多種生物學(xué)過程，包括基因表達(dá)調(diào)控和轉(zhuǎn)座子活性的調(diào)節(jié)，這些過程可能在不改變DNA序列[56-59]的情況下引起相應(yīng)的形態(tài)學(xué)變化。

4.1 異源多倍體與DNA甲基化

大量新物種來源于異源多倍體，因此異源多倍體是最廣泛的物種形成模式之一。然而，異源多倍體的形成需要2個親本基因組在1個共同的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮作用，這可能涉及到表觀遺傳變化。

Xu等采用甲基化敏感性擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）方法對白菜的DNA甲基化進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，約有1.7%的片段在基因組加倍時發(fā)生了甲基化改變，表明基因組的加倍使胞嘧啶甲基化發(fā)生變異[60]。還有研究發(fā)現(xiàn)，單一合成甘藍(lán)多倍體系之間的變異，可導(dǎo)致開花時間等性狀的遺傳和表型差異[61-62]及分子變異[63]。除此之外，Lukens等研究了甘藍(lán)和白菜雙單倍體雜交，得到49個異源多倍體植株在大量位點上存在遺傳和表觀遺傳變異，在理想狀態(tài)下，植株形態(tài)是一致的，但S0多倍體后代的CpG甲基化表觀遺傳程度高且變化罕見[64]。遠(yuǎn)緣雜交早期世代發(fā)生遺傳變異，如蘿卜和芥藍(lán)雜種的F4代至F10代異源四倍體體細(xì)胞染色體數(shù)目變化表明，早期便發(fā)生DNA甲基化變異從而導(dǎo)致世代染色體數(shù)目不同[23]。

4.2 DNA甲基化的遺傳力和可逆性

據(jù)報道，植物中胞嘧啶甲基化（MC）模式以自發(fā)或誘導(dǎo)的2種方式來改變，并通過不同的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶通過有絲分裂傳遞[65]。然而，人們對DNA甲基化的誘導(dǎo)性變化是否可以傳遞了解得較少。Johannes等通過研究證明，擬南芥表觀遺傳基因重組自交系中的DNA甲基化變化至少在8代之間傳播，而基因DNA序列沒有發(fā)生改變[66]。與此同時，李象松等對人工合成的蘿卜-芥藍(lán)異源四倍體F4代、F10代用甲基化敏感性擴(kuò)增多態(tài)性檢測發(fā)現(xiàn)，甲基化程度分別為3061%、33.10%[67]。Li等也通過蘿卜和芥藍(lán)的屬間雜交得到Raphanobrassica的異源多倍體F4代至F10代，經(jīng)MSAP檢測，胞嘧啶甲基化模式在雜交和二倍體形成過程中發(fā)生了明顯變化[23]。除此之外，甘藍(lán)與莖瘤芥嫁接組成了TTC（2，3，5-三苯基氯化四氮唑）嵌合莖尖分生組織（SAM），GS1（嫁接-自交）代中與莖瘤芥相比有529%～6.59%的甲基化變化，GS5代中有31.58%的甲基化變化，其余DNA的甲基化改變則逐漸恢復(fù)到原來的狀態(tài)，說明嫁接誘導(dǎo)的DNA甲基化變化是可遺傳的，也是可逆的[68]。因此，表觀遺傳變化是指由潛在DNA序列的改變以外的機(jī)制引起的遺傳變化，這種變化可持續(xù)多代[69-70]。

利用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（SRAP）[71-72]對白菜和黑芥雜交材料進(jìn)行分析表明，同源四倍體的片段是同源二倍體的2倍，此外，異源四倍體中的新片段是異源二倍體的2倍。當(dāng)異源四倍體（F1）進(jìn)行自交時，F(xiàn)2代表現(xiàn)出不同的表型和遺傳模式，表明在廣泛的雜交和基因組加倍中，遺傳變化的程度與多倍體水平呈正相關(guān)[73]。

4.3 小RNAs與DNA甲基化

遠(yuǎn)緣雜交會導(dǎo)致基因組復(fù)制和異源多倍體的形成，異源多倍體是研究植物進(jìn)化的重要材料。最近的研究表明，小RNAs，特別是24 nt siRNAs（小干擾RNA）在基因組中起著重要的作用，是闡明異源多倍體機(jī)制的關(guān)鍵。Ghani等研究白菜和黑芥雜種異源多倍體的小RNA表明，MicroRNA（miRNAs）的百分比與多倍體水平呈正相關(guān)，而siRNAs和DNA甲基化的百分比與多倍體水平呈負(fù)相關(guān)[74]。siRNAs和DNA甲基化的穩(wěn)定遺傳可維持基因組穩(wěn)定性，而miRNAs的表達(dá)變異則調(diào)控基因表達(dá)，誘導(dǎo)表型變異。與此同時，在研究擬南芥雜種中也發(fā)現(xiàn)，小RNA可作為抑制基因組重組的基因緩沖劑[75]。

5 展望

遠(yuǎn)緣雜交作為蔬菜遺傳改良中實現(xiàn)不同物種間優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)移以及創(chuàng)造新種質(zhì)資源的有效方法，一直受到人們的關(guān)注。國內(nèi)外已有不少關(guān)于屬間雜交成功的例子，但是通過人工雜交授粉、組織培養(yǎng)、體細(xì)胞雜交等改良技術(shù)仍然沒有使蘿卜屬與蕓薹屬屬間雜交的結(jié)實率和雜種獲得率得到很大的提高。因此，仍需要不斷探索關(guān)于屬間雜交不親和性的機(jī)制。異源多倍體在植物物種的起源和進(jìn)化中起著重要作用，但是關(guān)于2個基因組如何在1個核內(nèi)與異源多倍體單個親本細(xì)胞質(zhì)協(xié)調(diào)還尚不清楚，關(guān)于DNA甲基化如何在異源多倍體形成和發(fā)育中起作用依然知之甚少。隨著組織培養(yǎng)、細(xì)胞遺傳學(xué)和DNA甲基化等學(xué)科的迅猛發(fā)展，未來在蘿卜屬與蕓薹屬的屬間雜交會為育種改良創(chuàng)造更多新種質(zhì)和新品種，從而為深入研究物種進(jìn)化提供原材料。

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